多肽是由各種氨基酸分子之間脫水形成肽鍵相連的有機(jī)物, 其分子質(zhì)量在1~10 kDa, 介于小分子和生物大分子之間。存在于體內(nèi)的諸多信號(hào)分子都屬于肽或蛋白質(zhì), 疾病的發(fā)生發(fā)展離不開這些肽或蛋白質(zhì)。就目前已知的活性肽而言, 大部分都是由機(jī)體分泌或代謝轉(zhuǎn)化而來(lái)。因此, 按照活性肽的來(lái)源可以將肽分為兩類:第一類是來(lái)源于生物體本身的蛋白質(zhì)及活性肽, 稱為內(nèi)源性活性肽。內(nèi)源性活性肽在體內(nèi)含量少、分布廣、效應(yīng)極強(qiáng)。第二類是來(lái)源于動(dòng)植物的活性多肽以及抗生素等, 稱為外源性活性肽。外源性活性肽作用強(qiáng)、分布廣泛。內(nèi)源性活性肽和外源性活性肽構(gòu)成的多肽庫(kù)為藥物研發(fā)提供了新穎的結(jié)構(gòu)骨架, 許多上市藥物都源自多肽化合物的發(fā)現(xiàn)。

但是經(jīng)典的多肽結(jié)構(gòu)對(duì)體內(nèi)蛋白酶的穩(wěn)定性較差, 進(jìn)入體內(nèi)很快會(huì)被降解; 此外, 大多生物活性肽生物利用度比較差, 無(wú)法口服, 需要通過(guò)改變劑型進(jìn)而研發(fā)獲取適合的給藥途徑。基于以上這些因素, 需要對(duì)活性肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與化學(xué)改造^[1]。活性肽改造的目的多種多樣, 主要包括提高活性肽與受體的親和力及選擇性; 增強(qiáng)多肽分子的藥代穩(wěn)定性, 降低活性肽在體內(nèi)的降解或者減少活性肽在體內(nèi)的消除; 提高活性肽的透膜能力; 改善疏水肽的水溶性等。本文針對(duì)不同改造目的總結(jié)歸納了肽類分子結(jié)構(gòu)修飾改造策略, 根據(jù)是否對(duì)肽鏈骨架進(jìn)行修飾, 將這些修飾策略分為兩類:一類是針對(duì)肽鏈骨架的改造, 包括非天然氨基酸修飾、偽肽化策略、逆肽策略、環(huán)化策略、末端結(jié)構(gòu)修飾等; 另一類是在多肽骨架不變的基礎(chǔ)上, 引入其他基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和性能改造, 包括高級(jí)脂肪酸修飾、聚乙二醇修飾、蛋白融合策略、膽固醇修飾等。通過(guò)綜合運(yùn)用這些先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)修飾策略, 能夠顯著提高多肽類化合物的成藥性, 為開發(fā)多肽類創(chuàng)新藥物提供理論指導(dǎo)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與藥理活性之間的關(guān)系一直都是藥物化學(xué)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容?；钚允腔衔镩_發(fā)成藥物的前提, 多肽也是如此。部分天然肽類分子或人工合成的肽生物活性差, 需要通過(guò)化學(xué)修飾提高肽類分子與受體的親和力, 改善肽的活性。提高肽類分子活性的主要方法包括末端結(jié)構(gòu)修飾、拼接策略、環(huán)化策略、非天然氨基酸修飾、偽肽策略以及膽固醇修飾等。

對(duì)肽鏈骨架進(jìn)行修飾和改造以提高肽類分子活性的主要方法包括末端結(jié)構(gòu)修飾、拼接策略、環(huán)化策略、非天然氨基酸修飾、偽肽策略等。

N端裸露和C端裸露的多肽容易受到肽鏈外切酶的識(shí)別, 從而被切割降解失去活性。而將N末端和C末端進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾, 一方面可以提高肽類分子的代謝穩(wěn)定性, 另一方面可以保持甚至提高肽類分子的活性。Stoermer等^[2]報(bào)道了三肽(KKR序列)醛類化合物作為西尼羅病毒(west Nile virus, WNV)蛋白酶抑制劑; 尹正課題組報(bào)道了三肽(KRR序列)醛類化合物作為登革熱病毒(Dengue virus, DENV)蛋白酶抑制劑, 并且相較于其他四肽醛類化合物活性顯著提高^[3]。基于此類研究報(bào)道, Andreas等^[4]認(rèn)為不同氨基末端結(jié)構(gòu)修飾的三肽醛類化合物對(duì)活性有不同影響, 因此他們對(duì)N端Cap區(qū)進(jìn)行考察, 得到不同?；揎椀娜娜╊惢衔? 并且發(fā)現(xiàn)不同酰基化修飾對(duì)化合物的抗病毒活性有較大影響(表 1)^[4], 可以看出N端苯乙?；揎椀娜娜?b>2對(duì)登革熱病毒和西尼羅病毒都有較好的抑制活性, 而N端4-苯基苯乙?；揎椀娜娜?b>11相比于2對(duì)西尼羅病毒的抑制活性提高近7倍。這一點(diǎn)表明氨基末端的結(jié)構(gòu)修飾對(duì)肽類化合物的活性有一定影響, 可以作為肽類化合物改造的一種策略。

表 1 N-cap structure modification to affect anti-viral activity against viral protease [4]

與氨基端結(jié)構(gòu)修飾相對(duì)應(yīng), 羧基端結(jié)構(gòu)修飾在肽類分子的修飾改造也具有廣泛應(yīng)用, C-末端結(jié)構(gòu)修飾策略成功地在各類病毒蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)改造中使用。丙肝病毒NS3/4A蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶, 目前大部分絲氨酸蛋白酶抑制劑都含有親電基團(tuán), 與催化三聯(lián)體的絲氨酸羥基形成共價(jià)鍵。研究人員從十肽底物出發(fā)經(jīng)過(guò)肽鏈的簡(jiǎn)化以及羧基末端結(jié)構(gòu)修飾得到活性肽醛19, 其對(duì)HCV NS3/4A蛋白酶的結(jié)合常數(shù)為12 μmol·L^-1, 但醛基的化學(xué)和代謝穩(wěn)定性較差。因此, 研究人員對(duì)醛基末端進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾, 以α-鹵代酮、雜代酮、α-二酮和α-酮酰胺替換醛基, 得到的酮酰胺化合物20對(duì)絲氨酸蛋白酶NS3/4A的結(jié)合常數(shù)提高了12倍。分析酮酰胺20與絲氨酸蛋白酶的相互作用(圖 1), 研究人員發(fā)現(xiàn)酮酰胺結(jié)構(gòu)既可以與139位絲氨酸形成共價(jià)結(jié)合, 又可以與附近的137位谷氨酸和138位絲氨酸殘基形成氫鍵作用, 增強(qiáng)了化合物與NS3/4A蛋白酶的結(jié)合, 因而其抗病毒活性提高^[5]。

圖 1 C-terminal structure modification to improve activity against serine protease

EV71 3C蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶。尹正等^[6]發(fā)現(xiàn)了對(duì)EV71病毒具有較好抑制活性的肽醛分子21 (EC₅₀=0.11 μmol·L^-1), 考慮到醛基的穩(wěn)定性較差, 成藥性質(zhì)不佳。他們?cè)谶M(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾中, 針對(duì)醛基進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化, 得到羥基氰類化合物22, 該化合物對(duì)EV71的活性為0.056 μmol·L^-1。通過(guò)分子對(duì)接, 分析化合物22與EV71 3C蛋白酶的相互作用, 分子對(duì)接結(jié)果表明(圖 2), 相比于醛基, 羥基氰結(jié)構(gòu)中的氰基與146位谷氨酰胺和24位谷氨酸通過(guò)水分子形成氫鍵, 增強(qiáng)了化合物與EV71 3C蛋白酶的結(jié)合, 因而活性得以提高^[6, 7]。

圖 2 C-terminal structure modification to improve activity against EV71 3C protease. Figure derived from Zhai Y, et al[6]

在肽類化合物的改造中, 往往需要對(duì)不同位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行優(yōu)化和改造, 拼接策略是一個(gè)高效的結(jié)構(gòu)優(yōu)化方法。首先, 分別對(duì)N端和C端結(jié)構(gòu)修飾改造得到活性較優(yōu)的化合物, 然后將優(yōu)勢(shì)片段進(jìn)行拼接, 即可快速獲得活性更高的化合物。擬肽化合物23是一個(gè)登革熱病毒蛋白酶抑制劑, 其抑制活性IC₅₀為13.3 μmol·L^-1。在對(duì)該化合物改造的過(guò)程中, 研究人員就采用了分別優(yōu)化N端和C端的研究策略。在N端結(jié)構(gòu)改造中, 研究人員發(fā)現(xiàn)肽類分子24, 即N端Cap結(jié)構(gòu)修飾的化合物, 活性提升, 其IC₅₀達(dá)到2.5 μmol·L^-1。在C端側(cè)鏈改造過(guò)程中研究人員也發(fā)現(xiàn)將正丁基側(cè)鏈替換為苯基得到化合物25, 同樣可以提高化合物對(duì)登革熱病毒的抑制活性, 活性提升近4倍?？紤]到這兩個(gè)修飾策略都可以提高化合物的活性, 研究人員將兩個(gè)優(yōu)勢(shì)片段組合拼接, 得到化合物26, 其對(duì)登革熱病毒的抑制活性為0.6 μmol·L^-1, 活性提高了近20倍(圖 3)^[8]。

圖 3 Splicing strategy to improve DENV inhibitory activity

許多情況下, 直鏈肽的分子柔性造成構(gòu)象發(fā)生變化, 使其與受體結(jié)合的強(qiáng)度及選擇性下降。此外, 生物體內(nèi)的氨肽酶及羧肽酶也易于從直鏈肽兩個(gè)端基逐步切割肽鏈, 使之降解。因此肽鏈的環(huán)化改造, 使其構(gòu)象限定是改善肽類分子生物穩(wěn)定性、提高生物活性的重要結(jié)構(gòu)改造策略^[9]。研究表明, 從直鏈肽改為環(huán)肽后, 許多化合物的生物活性提高十幾倍至幾萬(wàn)倍。許多具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性的天然產(chǎn)物肽往往含有不同類型的主鏈環(huán)化結(jié)構(gòu)。因此, 環(huán)化策略是多肽結(jié)構(gòu)修飾改造的一個(gè)重要策略。

線性八肽化合物27對(duì)登革熱病毒NS2B-NS3蛋白酶有較弱的結(jié)合活性(K_i=42 μmol·L^-1)。Xu等^[10]推測(cè)線性肽結(jié)合活性較差的原因可能是線性肽占用的空間較大, 無(wú)法與蛋白酶有效地結(jié)合; 而用環(huán)肽則可以改變線性肽所占用的空間, 提高化合物對(duì)NS2B-NS3蛋白酶的結(jié)合活性。他們?cè)O(shè)計(jì)合成了系列環(huán)肽結(jié)構(gòu), 并且對(duì)這類環(huán)肽的結(jié)合活性進(jìn)行測(cè)試。發(fā)現(xiàn)環(huán)肽28的構(gòu)象使得其可以較好地與登革熱病毒NS2B-NS3蛋白酶結(jié)合, 相較于線性肽活性提高近20倍, K_i值達(dá)到2.2 μmol·L^-1 (圖 4)。

圖 4 Cyclization strategy to improve activity against NS2B-NS3 protease. Figure derived from Xu SQ, et al[10]

除了首尾相連的大環(huán)化策略, 局部環(huán)化往往能夠局部限定環(huán)化區(qū)域的肽類化合物構(gòu)象, 穩(wěn)定肽類化合物與受體的相互作用, 提高肽類化合物的活性。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3是一種直接將細(xì)胞外受體的信號(hào)傳遞至核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。STAT3的持續(xù)激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖從而形成腫瘤并且抑制腫瘤細(xì)胞凋亡^[11-13]。美國(guó)密歇根大學(xué)王少萌等^[14]早期發(fā)現(xiàn)gp130 pYLPQTV肽29與STAT3受體有較強(qiáng)的親和力。研究表明, gp130磷酸肽中的蘇氨酸和纈氨酸可以被芐胺替代而不改變肽和STAT3之間的結(jié)合活性, 因此, 研究人員切斷蘇氨酸和纈氨酸并用芐胺封閉碳端, 得到了截?cái)嗔姿犭?b>30, 30與STAT3受體的結(jié)合力K_i為350 nmol·L^-1。通過(guò)分子對(duì)接, 他們發(fā)現(xiàn)亮氨酸側(cè)鏈異丁基和脯氨酸五元環(huán)可以并環(huán)形成雙環(huán)內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)而不破壞肽30 β轉(zhuǎn)角的構(gòu)象。因此, 采用局部環(huán)化策略, 他們?cè)O(shè)計(jì)合成了構(gòu)象限制的雙環(huán)類肽化合物31, 其與STAT3受體的結(jié)合力K_i為17 nmol·L^-1, 活性提高了近20倍。分子對(duì)接結(jié)果表明, 雙環(huán)內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)可以很好保持30的β轉(zhuǎn)角構(gòu)象。為了驗(yàn)證Cbz保護(hù)基是否和肽31與STAT3受體結(jié)合相關(guān), 他們將芐氧羰基替換為乙?；? 得到的肽32與STAT3受體的結(jié)合力K_i值為15 nmol·L^-1, 與肽31活性相當(dāng), 說(shuō)明Cbz并非活性必須。隨后, 他們?cè)u(píng)價(jià)了肽32對(duì)兩種含有高磷酸化STAT3受體的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和MDA-MB-468的抑制活性, 但32在100 μmol·L^-1水平下對(duì)這兩種腫瘤細(xì)胞并沒(méi)有表現(xiàn)出抑制活性, 可能是磷酸肽的極性太大, 無(wú)法通過(guò)細(xì)胞膜。為了增強(qiáng)32對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性, 他們將高級(jí)脂肪酸引入磷酸肽的氮端, 得到了脂肪酸修飾的磷酸肽33, 33與STAT3受體的結(jié)合力K_i值為10 nmol·L^-1, 而且肽33對(duì)兩種細(xì)胞的抑制活性IC₅₀分別為25和35 μmol·L^-1, 在細(xì)胞水平顯示了一定的抑制活性, 也表明脂肪酸修飾可以改變肽類化合物的性質(zhì), 提高肽類化合物的透膜性(圖 5)^[15]。

圖 5 Partial cyclization strategy to improve peptide binding affinity with STAT3 receptor

卡托普利是第一個(gè)報(bào)道的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)抑制劑, 1981年被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療高血壓。臨床研究表明, 卡托普利的巰基可能會(huì)引起患者皮疹和食欲減退等不良反應(yīng)。為了解決這一問(wèn)題, 研究人員研發(fā)新型ACE抑制劑作為降壓藥物。在卡托普利研發(fā)早期, 活性化合物34具有一定的ACE抑制活性, 其IC₅₀為4.9 μmol·L^-1。對(duì)34的亞甲基用氮原子進(jìn)行生物電子等排, 得到二肽先導(dǎo)化合物35, 其活性提高1倍^[16]。由于氮原子的引入, 化合物的親水性有所增強(qiáng); 為了平衡氮原子引起的親水性增強(qiáng), 研究人員嘗試在氨基酸的α位引入烷基側(cè)鏈平衡親水性變化, 結(jié)果得到的化合物36活性進(jìn)一步增強(qiáng)至0.09 μmol·L^-1。隨后, 研究人員對(duì)α位烷基側(cè)鏈進(jìn)行了詳細(xì)的構(gòu)效關(guān)系考察, 最終確定苯乙基取代時(shí), 活性最優(yōu)^[17], 將羧基乙酯化開發(fā)獲得前藥依那普利37, 依那普利于1985年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于高血壓和心力衰竭的治療。37對(duì)ACE的抑制活性相比于36活性提高了74倍, 表明非天然氨基酸的引入可以增強(qiáng)肽類分子的藥理活性(圖 6)。

圖 6 Introduction of unnatural amino acids to improve ACE inhibitory activity

偽肽則是通過(guò)模擬多肽水解的過(guò)渡態(tài), 利用生物電子等排原理對(duì)易水解的酰胺鍵進(jìn)行替換, 使多肽免于蛋白酶的水解切割從而保留甚至提高肽類化合物的藥理活性。圖 7列出了一些偽肽的代表結(jié)構(gòu)^[18]。

圖 7 Representative structures of pseudopeptides

片段38 (羥基亞甲基)是眾多HIV蛋白酶抑制劑、腎素抑制劑和β-分泌酶抑制劑^[19]共有的結(jié)構(gòu)片段。其基本的設(shè)計(jì)原理就是利用偽肽策略, 模擬酰胺鍵水解過(guò)程中的過(guò)渡態(tài), 替換易水解的酰胺鍵。Szelke等^[20]通過(guò)在腎素底物42的亮氨酸-纈氨酸(Leu-Val)片段中采用羥基亞甲基替換酰胺鍵, 得到偽肽抑制劑43, 對(duì)HIV-1蛋白酶抑制活性顯著提高(圖 8), 其IC₅₀值為0.000 7 μmol·L^-1。

圖 8 Pseudopeptide strategy to improve anti-HIV-1 protease activity

其中縮硅酮片段41也有廣泛應(yīng)用, 由于碳原子和硅原子同屬一個(gè)主族, 兩個(gè)原子的性質(zhì)十分相似, 而硅原子相比碳原子更傾向于sp³雜化, 片段41不容易發(fā)生消除反應(yīng)生成硅酮, 縮硅酮的穩(wěn)定性要高于縮酮, 因此在設(shè)計(jì)和改造活性肽的時(shí)候引入41片段既可以增強(qiáng)與酶活性中心的相互作用, 又具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性, 在藥物化學(xué)化合物設(shè)計(jì)中具有廣泛應(yīng)用(圖 9)。片段41在很多活性肽類似物分子上顯示出良好活性, 例如含有片段41的ACE抑制劑44, 其對(duì)ACE酶的抑制活性達(dá)到了3.8 nmol·L^-1; 而含有片段41的HIV蛋白酶抑制劑45對(duì)蛋白酶的抑制活性也達(dá)到2.7 nmol·L^-1, 表明該類結(jié)構(gòu)在活性肽結(jié)構(gòu)改造中有重要意義^[21]。

圖 9 Representative silicon containing pseudopeptide inhibitors

外接基團(tuán)修飾以提高肽類分子活性的主要方法是膽固醇修飾。

膽固醇修飾也是多肽類分子的重要結(jié)構(gòu)修飾策略。膽固醇的引入常?？梢栽谔岣咂湓隗w內(nèi)半衰期的同時(shí)增強(qiáng)多肽的藥理活性。Wang等^[22]用細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)多肽分子的抗病毒活性, 發(fā)現(xiàn)多肽m4HR具有一定抗HIV-1活性(IC₅₀ =36 910 nmol·L^-1)。當(dāng)在m4HR C末端外接膽固醇分子得到化合物46, 其抗病毒活性提高200倍(IC₅₀ =57.2 nmol·L^-1)。進(jìn)一步在N端修飾, 得到的肽類化合物對(duì)HIV-1的抑制活性進(jìn)一步提升(表 2)。其中活性最好的是肽類分子47, 其IC₅₀達(dá)到8.3 nmol·L^-1, 該類化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化的實(shí)例進(jìn)一步證明了膽固醇修飾在多肽藥物活性優(yōu)化的重要應(yīng)用。

表 2 Cholesterol conjugation to improve anti-viral activity against HIV-1

多肽的基本組成單元是氨基酸, 其本質(zhì)與蛋白質(zhì)相同, 因而多肽類分子是許多蛋白酶水解的底物, 而這一特點(diǎn)嚴(yán)重限制了多肽類藥物的開發(fā)研究。一般而言, 大部分多肽類藥物無(wú)法口服, 否則就會(huì)被胃蛋白酶以及胰蛋白酶等消化破壞; 其次, 即使通過(guò)注射給藥, 多肽類藥物也有可能在血液以及組織中被蛋白酶降解失活, 因此多肽類藥物的生物利用度很低, 以至于多肽類分子在臨床治療中受到很大限制^[23]。為了減弱或避免蛋白酶對(duì)多肽類分子的降解, 必須要利用化學(xué)方法或其他方法對(duì)多肽分子進(jìn)行修飾改造, 以提高多肽的代謝穩(wěn)定性, 為新藥研發(fā)中解決多肽的代謝穩(wěn)定性問(wèn)題提供一些思路和參考。增強(qiáng)多肽分子代謝穩(wěn)定性的主要方法包括非天然氨基酸修飾、偽肽化策略、逆肽策略、環(huán)化策略以及高級(jí)脂肪酸修飾、蛋白融合策略、聚乙二醇修飾等。

對(duì)肽鏈骨架進(jìn)行修飾和改造以增強(qiáng)多肽分子代謝穩(wěn)定性的主要方法包括非天然氨基酸修飾、偽肽化策略、逆肽策略、環(huán)化策略等。

天然活性肽的組成常常都是天然氨基酸。天然活性肽容易受到體內(nèi)蛋白酶降解, 從而降低其在體內(nèi)的半衰期, 導(dǎo)致天然活性肽在體內(nèi)發(fā)揮藥效時(shí)間縮短, 不利于成藥。β氨基酸作為非天然氨基酸, 在體內(nèi)不易被蛋白酶識(shí)別水解, 在活性肽的結(jié)構(gòu)改造與修飾中發(fā)揮重要作用。

化合物51是一個(gè)神經(jīng)降壓素, 其作用于神經(jīng)降壓素受體1和2 (NTSR1和NTSR2)兩個(gè)亞型。神經(jīng)降壓素及其受體與痛覺(jué)缺失的調(diào)節(jié)、食物攝取以及腫瘤生長(zhǎng)具有密切關(guān)系^[24]。研究人員對(duì)神經(jīng)降壓素51進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化, 經(jīng)過(guò)截?cái)嗖呗缘玫搅撕械诎宋坏降谑话被嵝蛄械暮?jiǎn)化肽52 (NTSR1 K_i=0.24 nmol·L^-1; NTSR2 K_i=1.2 nmol·L^-1), 其對(duì)NTSR1和NTSR2受體的活性均比神經(jīng)降壓素51有所提高。然而, 簡(jiǎn)化肽52容易受到體內(nèi)酶代謝作用, 因此其在體內(nèi)半衰期很短。針對(duì)這一特點(diǎn), 研究人員嘗試引入β氨基酸(圖 10), 得到活性肽53, 其對(duì)NTSR1和NTSR2受體的活性雖然下降(NTSR1 K_i =8 nmol·L^-1; NTSR2 K_i=25 nmol·L^-1), 但半衰期延長(zhǎng)至32 h。之后研究人員又將N端的精氨酸替換為β-精氨酸得到肽54。54相比于53活性略有提高(NTSR1 K_i =6 nmol·L^-1; NTSR2 K_i=12 nmol·L^-1), 而且54的半衰期大于7天^[25, 26], 極大地提高了活性肽在體內(nèi)的停留時(shí)間, 增強(qiáng)了活性肽在體內(nèi)的藥代穩(wěn)定性。

圖 10 Introduction of β-amino acids to improve the metabolic stability of peptides

肽類小分子55是一個(gè)廣泛研究的金屬蛋白酶EP24.15 (endopeptidase)抑制劑。EP24.15與下丘腦對(duì)垂體功能的調(diào)節(jié)及血壓調(diào)節(jié)有重要關(guān)聯(lián), 文獻(xiàn)報(bào)道EP24.15還可能與Aβ蛋白的聚集和阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease, AD)相關(guān), 因此EP24.15是精神系統(tǒng)疾病的研究熱點(diǎn)。雖然肽類小分子55對(duì)EP24.15的抑制活性很強(qiáng)(IC₅₀=0.06 μmol·L^-1), 但它容易受到與EP24.15相關(guān)的蛋白酶——中性內(nèi)肽酶EP24.11水解。因此, 研究人員的主要研發(fā)目標(biāo)是提高55對(duì)中性內(nèi)肽酶EP24.11的穩(wěn)定性。他們嘗試將55中的丙氨酸、酪氨酸和羧基末端分別用β-丙氨酸、β-苯丙氨酸和β-氨基丙酸替換, 得到β肽56對(duì)EP24.15的抑制活性雖然有所下降(IC₅₀=2.8 μmol·L^-1), 但對(duì)中性內(nèi)肽酶EP24.11的穩(wěn)定性顯著提高(圖 11), 幾乎不受其降解影響^[27]。

圖 11 Modification of 55 with β-amino acids to yield an inhibitor with complete stability against EP24.11

研究人員用圖 12的示意圖解釋引入β氨基酸可以提高肽類分子對(duì)中性內(nèi)肽酶的穩(wěn)定性。對(duì)于天然α多肽, 在特異性的蛋白酶切割位點(diǎn), 水分子首先與酰胺鍵形成氫鍵作用, 從而有利于水分子對(duì)酰胺鍵的進(jìn)攻最后完成酰胺鍵的切割; 對(duì)β多肽而言, 由于增加了一個(gè)亞甲基, 多肽整體的構(gòu)象發(fā)生變化, 原本蛋白酶切割中心的水分子無(wú)法與酰胺鍵形成氫鍵, 不利于蛋白酶對(duì)酰胺鍵的切割, 因而β多肽比α多肽具有更強(qiáng)的抗水解能力^[28]。

圖 12 Schematic diagram of how a β-peptide may not be cleaved by the peptidase

阿片受體與疼痛密切相關(guān), 主要包括μ受體、δ受體和κ受體等幾種亞型。阿片肽則是一種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì), 通過(guò)與這些受體結(jié)合發(fā)揮藥理作用。研究人員發(fā)現(xiàn)內(nèi)嗎啡肽57是μ受體的內(nèi)源性底物肽, 具有較強(qiáng)的藥理活性, 其對(duì)μ受體的激動(dòng)活性為14.40 nmol·L^-1, 相較于嗎啡不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng); 而且, 內(nèi)嗎啡肽在有效劑量下不易誘發(fā)呼吸抑制和心血管疾病。因此, 內(nèi)嗎啡肽引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。然而, 內(nèi)嗎啡肽仍存在一些問(wèn)題, 其中之一就是其代謝穩(wěn)定性較差, 半衰期僅為16.9 min。蘭州大學(xué)王銳團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)含有非天然氨基酸的內(nèi)嗎啡肽類似物具有較強(qiáng)的代謝穩(wěn)定性(圖 13), 而且可以在一定程度上進(jìn)一步提高內(nèi)嗎啡肽對(duì)μ受體的活性。他們首先將C末端苯丙氨酸替換為非天然氨基酸, 得到化合物58, 其對(duì)μ受體的激動(dòng)活性為0.033 4 nmol·L^-1, 相比于內(nèi)嗎啡肽57提高了430倍; 而且該化合物在腦膜勻漿中的半衰期延長(zhǎng)至85.9 min, 與內(nèi)嗎啡肽相比提高了近4倍^[29]; 隨后, 他們?cè)诖斯ぷ鞯幕A(chǔ)上進(jìn)一步把酪氨酸和脯氨酸片段用非天然氨基酸替換, 得到化合物59, 其對(duì)μ受體的活性進(jìn)一步提高, 達(dá)到0.042 0 pmol·L^-1。而且化合物59在腦膜勻漿中的半衰期超過(guò)600 min^[30], 解決了內(nèi)源性嗎啡肽半衰期短的問(wèn)題。因此, 非天然氨基酸的引入對(duì)改善肽類化合物的代謝穩(wěn)定性具有重要意義。

圖 13 Introduction of unnatural amino acids to improve the stability of endomorphin and its potent analogues

天然多肽大多由L型氨基酸組成, 容易受到各種蛋白酶的降解而失去活性。蛋白酶的水解反應(yīng)一般都是立體專一的, 引入D型氨基酸使多肽的構(gòu)型發(fā)生變化, 進(jìn)而使得修飾的多肽不易被蛋白水解酶水解, 因此D型氨基酸修飾的多肽可以提高對(duì)蛋白酶的降解作用。

黃體激素釋放激素(luteinizing hormone releasing hormone, LHRH)是由下丘腦分泌的具有調(diào)節(jié)生殖功能的十肽, 該激素與垂體前葉的黃體激素釋放激素受體(gonadotropin-releasing hormone receptor, GnRHR)結(jié)合, 可以調(diào)控黃體激素的合成和分泌。除此之外, 在人類多種惡性腫瘤中, LHRH與其他生長(zhǎng)因子一起調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。LHRH及類似物可以通過(guò)抑制垂體-性腺軸的功能從而抑制激素依賴性腫瘤細(xì)胞的增殖, 因此LHRH及類似物目前在臨床上用于治療激素依賴性腫瘤如前列腺癌和乳腺癌等。然而天然的LHRH第5、6位以及第6、7位氨基酸殘基間肽鍵穩(wěn)定性較差, 在體內(nèi)極易受到肽鏈內(nèi)切酶的作用而裂解, LHRH在體內(nèi)的半衰期僅有2~4 min。為了提高LHRH在體內(nèi)的穩(wěn)定性, 研究人員嘗試在6位引入不同種類的D型氨基酸, 得到上市藥物如那法瑞林60和曲普瑞林61, 半衰期相較于LHRH均有不同程度的提高, 其半衰期分別為3 h和4 h (表 3)^[31]。

表 3 Introduction of D amino acids to improve the stability of peptides

肽鍵(-CONH₂-)是肽類分子的特征, 而肽鍵在體內(nèi)容易被蛋白酶識(shí)別降解, 這是肽類分子穩(wěn)定性差的原因之一。偽肽則是利用生物電子等排原理將肽鍵中的一種或兩種以上的原子用其他原子替代。由于偽肽從本質(zhì)上改變了酰胺鍵的化學(xué)結(jié)構(gòu), 與蛋白或多肽同源結(jié)構(gòu)不同, 因此可以避免體內(nèi)蛋白酶的識(shí)別和水解, 從而提高肽類分子的穩(wěn)定性及活性。

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體與其胞內(nèi)突觸后致密蛋白(postsynaptic density protein-95, PSD-95)的蛋白-蛋白相互作用是治療缺血性腦病、神經(jīng)疼痛以及阿爾茲海默癥的一種潛在策略^[32]。Bach等^[33]報(bào)道, N-烷基化的谷氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-纈氨酸四肽化合物(N-甲基-ETAV) 62是NMDA/PSD-95蛋白-蛋白相互作用抑制劑(K_i=9.65 μmol·L^-1), 他們通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾得到一系列活性較強(qiáng)的四肽衍生物, 但是研究人員在改造過(guò)程中發(fā)現(xiàn)這類化合物的血漿穩(wěn)定性較差, 例如, 化合物62在人血漿中的半衰期只有113 min, 較差的代謝穩(wěn)定性限制了該類化合物的進(jìn)一步開發(fā)。為了改善化合物的血漿穩(wěn)定性, Bach等對(duì)該類化合物進(jìn)行偽肽化結(jié)構(gòu)修飾, 將酰胺鍵的氧原子用硫原子進(jìn)行替換, 得到不易被蛋白酶識(shí)別并水解的硫雜酰胺鍵。比較含硫雜酰胺鍵的偽肽63、64和含有酰胺鍵的化合物62, 可以發(fā)現(xiàn)含硫雜酰胺鍵的化合物雖然活性有所下降, 但血漿穩(wěn)定性顯著提高(圖 14), 尤其是化合物63, 在活性基本不變(K_i=10.8 μmol·L^-1)的同時(shí)血漿半衰期提高了50倍。研究結(jié)果表明, 硫雜酰胺鍵的偽肽化修飾是提高肽類化合物血漿穩(wěn)定性的有效策略。

圖 14 Thionamide pseudopeptides to improve stability of peptides

蛋白質(zhì)、激素、活性肽以及天然產(chǎn)物多肽是各種蛋白酶降解的底物, 因此存在著易受蛋白酶降解以及半衰期較短的特點(diǎn)。除了之前介紹的策略可以有效耐受蛋白酶的水解, 肽鍵方向的改變同樣可以改變蛋白酶對(duì)底物的識(shí)別作用, 從而達(dá)到抗降解的作用。這類改變肽鍵方向的多肽結(jié)構(gòu)修飾策略稱為逆肽化修飾, 相關(guān)的肽稱為逆肽或逆反肽。

β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)沉積物的形成可能是引起AD的重要過(guò)程。研究表明Aβ可溶性寡聚體有細(xì)胞毒性, 并且對(duì)大腦的記憶能力和學(xué)習(xí)能力具有潛在影響。在Aβ聚集的早期進(jìn)行抑制可有效治療AD。Taylor等^[34]報(bào)道了能有效抑制Aβ聚集的九肽65, 盡管65對(duì)Aβ寡聚體的聚集有較強(qiáng)的抑制作用, 但65存在多個(gè)水解位點(diǎn), 因此需要對(duì)65進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以提高其代謝穩(wěn)定性。對(duì)65進(jìn)行逆肽修飾, 得到逆肽66, 理論上逆肽可以保持與65相似的三維結(jié)構(gòu)從而使活性得到保持, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明逆肽66對(duì)Aβ寡聚體的聚集抑制活性并沒(méi)有發(fā)生顯著變化。Taylor等用蛋白質(zhì)降解實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)65和66的代謝穩(wěn)定性, 即將肽與人血漿或腦提取物共孵育24 h, 通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定溶液中原型肽含量?？梢园l(fā)現(xiàn)無(wú)論血漿還是腦提取物中, 逆肽66的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于65, 而且65的含量接近100%, 表明逆肽可以一定程度上提高化合物的代謝穩(wěn)定性(圖 15)。

圖 15 Inverse-peptide strategy to improve stability of peptides. Figure derived from Taylor M, et al[34]

肽去甲?；?peptide deformylase, PDF)是參與細(xì)菌蛋白質(zhì)生物合成和成熟的重要酶, 在細(xì)菌和真核生物的細(xì)胞器中, 蛋白質(zhì)的合成始于N-甲酰蛋氨酸, 因此新合成的多肽都含有甲酰化的N末端。PDF催化這些多肽的去甲酰化過(guò)程。PDF在細(xì)菌細(xì)胞中發(fā)揮的重要作用使其成為設(shè)計(jì)新型抗生素, 治療耐藥性病原體的新靶標(biāo)。研究人員在前期工作基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)化合物67具有一定的抗菌活性, 其對(duì)大腸桿菌PDF抑制活性K_i值為92 nmol·L^-1。但67在大鼠血漿中容易受到類胰蛋白酶的降解作用而失活。從圖 16中可以發(fā)現(xiàn), 67在大鼠血漿中孵育5 h約25%被降解。為了提高血漿穩(wěn)定性, 研究人員將P1'與P3'進(jìn)行環(huán)化, 設(shè)計(jì)合成環(huán)肽類似物68。研究結(jié)果表明, 相比于67, 環(huán)肽類似物68的抗菌活性有所提高, K_i值為74 nmol·L^-1, 而且血漿穩(wěn)定性大幅提高, 將68與大鼠血漿孵育5 h基本不被降解^[35]。

圖 16 Cyclization strategy to improve stability of peptides. Figure derived from Hu XB, et al[35]

α螺旋是大部分多肽分子都具有的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征, 然而人工合成的多肽分子在水溶液中并不能保持穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)^[36], 因此科研人員開發(fā)了一種以碳-碳鍵或其他連接鏈為支撐的骨架穩(wěn)定多肽α螺旋結(jié)構(gòu), 由這類方法得到的多肽稱為訂書肽(stapled peptide), 該方法本質(zhì)上也屬于環(huán)化修飾策略的一種。線性肽柔性大, 在舒展的構(gòu)象下, 容易暴露出更多酶解位點(diǎn), 增加了多肽被水解的概率, 從而導(dǎo)致多肽穩(wěn)定性降低^[37]。形成訂書肽可以約束線性多肽的構(gòu)象, 減少多肽被降解的概率。

β連環(huán)蛋白-B細(xì)胞淋巴瘤9 (B-cell lymphoma, BCL9)蛋白-蛋白相互作用對(duì)β連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要, 而這一相互作用是由BCL9蛋白中25個(gè)殘基的螺旋片段和β連環(huán)蛋白的結(jié)合槽介導(dǎo)。王少萌等發(fā)現(xiàn), 372位突變的BCL9肽69具有一定抑制β連環(huán)蛋白的活性(K_i=0.94 μmol·L^-1), 然而69穩(wěn)定性較差, 在細(xì)胞培養(yǎng)液中1 h降解75% (圖 17)。因此王少萌等設(shè)計(jì)了一類結(jié)構(gòu)穩(wěn)定, 不容易被代謝的BCL9肽^[38]。在設(shè)計(jì)過(guò)程中, 他們采用了點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)形成的三氮唑?yàn)橹谓Y(jié)構(gòu), 合成訂書肽70和71。訂書肽70和71對(duì)β連環(huán)蛋白的抑制活性分別為0.61 μmol·L^-1和0.19 μmol·L^-1, 活性保持。同時(shí)提高了線性肽的穩(wěn)定性, 70和71在細(xì)胞培養(yǎng)液中1 h僅分別降解30%和25%。

圖 17 Click chemistry mediated stapled peptide to improve stability of peptides. Figure derived from Kawamoto KA, et al[38]

外接基團(tuán)修飾以增強(qiáng)多肽分子代謝穩(wěn)定性的主要方法包括高級(jí)脂肪酸修飾、蛋白融合策略、聚乙二醇修飾等。

高級(jí)脂肪酸修飾是指在肽類藥物的特定位點(diǎn)通過(guò)化學(xué)方法以共價(jià)鍵的形式引入高級(jí)脂肪酸以改善肽類藥物的性質(zhì), 延長(zhǎng)半衰期。一般認(rèn)為, 高級(jí)脂肪酸修飾可以穩(wěn)定其結(jié)構(gòu), 提高多肽的穩(wěn)定性, 從而延長(zhǎng)多肽藥物在體內(nèi)的半衰期。同時(shí), 高級(jí)脂肪酸與細(xì)胞膜表面的磷脂結(jié)構(gòu)類似。因此, 脂肪酸修飾的多肽藥物往往也可以提高多肽藥物的脂溶性, 改善藥物在腸道內(nèi)的吸收以及黏膜透過(guò)性。此外, 高級(jí)脂肪酸可以與血清白蛋白(human serum albumin, HSA)結(jié)合, 結(jié)合后的復(fù)合體因分子過(guò)大而不容易轉(zhuǎn)運(yùn), 從而可以延長(zhǎng)多肽在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間^[39]。目前, 高級(jí)脂肪酸作為修飾結(jié)構(gòu)的研究發(fā)展仍然比較緩慢, 但高級(jí)脂肪酸作為體內(nèi)的一種內(nèi)源性物質(zhì), 一直吸引了研究人員的廣泛關(guān)注。根據(jù)水蛭素結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化得到的水蛭肽比伐盧定72 (Bivalirudin)是由The Medicines Company開發(fā)的抗凝藥物, 于2000年12月年被FDA批準(zhǔn)上市, 作為抗凝劑用于經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)治療中出現(xiàn)的不穩(wěn)定型心絞痛和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)。但是作為多肽類藥物, 72在體內(nèi)的暴露量較低(AUC_0-t為23.7 nmol·min·mL^-1), 半衰期短(t_1/2=15.1 min), 藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)較差。在進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療之前, 需要先進(jìn)行靜脈注射, 隨后靜脈滴注至手術(shù)結(jié)束, 患者依從性差。針對(duì)這一缺點(diǎn), 研究人員對(duì)比伐盧定類似物73進(jìn)行化學(xué)修飾, 主要的策略是用高級(jí)脂肪酸對(duì)氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行修飾。對(duì)比肽73和74, 其藥理活性基本保持不變, 而高級(jí)脂肪酸修飾的多肽74暴露量(AUC_0-t為1371.7 nmol·min·mL^-1)和半衰期(t_1/2=212.2 min)相較于未修飾的多肽73 (AUC_0-t為25.7 nmol·min·mL^-1, t_1/2=13.5 min)明顯改善(表 4), 暴露量和半衰期分別提高了58倍和14倍^[40]。

表 4 Introduction of fatty acid to improve the pharmacokinetic properties of bivalirudin analogs

上市的降糖多肽藥物利拉魯肽^[41]和索馬魯肽^[42]也都引入了高級(jí)脂肪酸修飾, 高級(jí)脂肪酸的引入增加了藥物的疏水性, 掩蓋二肽基肽酶4 (DPP-4)的結(jié)合位點(diǎn), 降低腎排泄, 提高半衰期。利拉魯肽是由諾和諾德公司研發(fā)的長(zhǎng)效GLP-1受體激動(dòng)劑, 其與天然GLP-1有97%的氨基酸序列相似性, 僅在34位將賴氨酸替換為精氨酸, 同時(shí)在26位賴氨酸側(cè)鏈引入由谷氨酸作為linker的16碳棕櫚酸側(cè)鏈。皮下注射利拉魯肽后, 其可在注射部位形成穩(wěn)定的七聚體, 在皮下組織緩慢吸收; 另外, 由于引入了長(zhǎng)鏈脂肪酸修飾, 掩蓋了DPP-4結(jié)合位點(diǎn); 同時(shí), 長(zhǎng)鏈脂肪酸的引入還使利拉魯肽與血清白蛋白形成可逆復(fù)合物, 極大地延長(zhǎng)了利拉魯肽在體內(nèi)的吸收時(shí)間, 提高了多肽類藥物的體內(nèi)半衰期。天然的GLP-1半衰期極短, 只有2 min左右; 而棕櫚酸修飾的利拉魯肽半衰期延長(zhǎng)至13 h, 提高了390倍(圖 18)^[43, 44]。索馬魯肽則是GLP-1(7-37)的第8位丙氨酸用氨基異丁酸替換, 34位的賴氨酸用精氨酸替換, 同時(shí)在26位賴氨酸側(cè)鏈由谷氨酸作為linker引入十八烷酸, 疏水性也更強(qiáng), 同時(shí)經(jīng)過(guò)短鏈的聚乙二醇修飾, 其半衰期大大延長(zhǎng)至一周。

圖 18 Introduction of fatty acid to improve the half-life of GLP-1 analogues

除了利用可逆的結(jié)合方式結(jié)合HSA, 共價(jià)不可逆的結(jié)合方式也常常用于多肽類藥物的改造中。艾博衛(wèi)泰(albuvirtide)是由南京前沿生物技術(shù)有限公司開發(fā)的全球首個(gè)長(zhǎng)效抗HIV-1藥物, 其結(jié)構(gòu)如圖 19所示。恩夫韋肽(enfuvirtide)是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)臨床使用的HIV-1融合抑制劑。然而恩夫韋肽75作為一個(gè)多肽藥物, 其在人體內(nèi)的半衰期只有3.5~4.4 h, 需要每天注射兩次, 患者的依從性較差。針對(duì)恩夫韋肽75半衰期較短的缺點(diǎn), 前沿生物技術(shù)有限公司開發(fā)了艾博衛(wèi)泰, 艾博衛(wèi)泰76是在多肽序列13位的賴氨酸側(cè)鏈中引入了3-馬來(lái)酰亞胺-丙酸(MPA)修飾(圖 19), MPA可與血清白蛋白中的巰基形成不可逆的共價(jià)結(jié)合, 而且結(jié)合速率快, 大大提高了多肽在人體內(nèi)的半衰期, 給藥頻率一周一次即可^[45]。艾博衛(wèi)泰已于2018年獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)批準(zhǔn)上市, 用于與其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物聯(lián)合使用, 治療HIV-1感染。

圖 19 Introduction of MPA to improve the half-life of anti-HIV-1 drug

蛋白融合策略是指利用基因工程技術(shù), 將蛋白或多肽分子與免疫球蛋白Fc片段或血清白蛋白HSA融合而產(chǎn)生新型分子的修飾策略。融合Fc或HSA片段之后的多肽分子, 分子尺寸顯著增大, 降低了腎對(duì)多肽藥物的清除率, 從而延長(zhǎng)多肽藥物的半衰期^[46]。禮來(lái)公司開發(fā)的降糖藥物度拉糖肽(dulaglutide)就是將GLP-1與IgG4 (Fc)融合而成的長(zhǎng)效降糖藥物^[47], 其生物半衰期大于90 h, 并且療效不弱于利拉魯肽, 其在2019年前三季度的銷售額達(dá)到29.20億美元, 超過(guò)利拉魯肽(2019年前三季度銷售額為24.47億美元)。

人血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì), 其半衰期長(zhǎng)達(dá)19天, 因此HSA蛋白融合可以延長(zhǎng)多肽藥物的半衰期。葛蘭素史克公司研發(fā)的長(zhǎng)效降糖藥物阿必魯肽(albighztide)是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)上市的HSA蛋白融合藥物, 阿必魯肽的半衰期長(zhǎng)達(dá)6~10天^[48]。因此, 蛋白融合策略是多肽藥物長(zhǎng)效化的有效手段。

聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)在體內(nèi)具有可降解、低毒性、無(wú)抗原性等特點(diǎn), 是一種常見的肽類分子修飾方法。PEG修飾可以改善肽類分子的穩(wěn)定性、減少蛋白酶的降解、不易被腎小球?yàn)V過(guò), 從而提高多肽藥物的穩(wěn)定性, 延長(zhǎng)藥物的半衰期。目前已有諸多PEG修飾的多肽藥物上市, 其中PEG修飾的干擾素α是這一結(jié)構(gòu)修飾策略的成功案例。干擾素α可以有效地抑制或清除乙型肝炎或丙型肝炎病毒, 但干擾素α作為多肽類藥物具有自身不可克服的缺點(diǎn), 其半衰期短, 僅為4 h, 需要每天注射一次。為了克服這一缺點(diǎn), 先靈葆雅研究所(Schering-Plough Research Institute, SPRI)致力于長(zhǎng)效干擾素α的研究。他們分析了干擾素α半衰期較短的原因, 認(rèn)為其分子過(guò)小容易被腎臟清除, 因此研究人員將PEG引入到干擾素α中(圖 20), 而修飾后的干擾素α整體分子尺寸變大, 不易被腎小球?yàn)V過(guò), 從而PEG修飾的干擾素α半衰期得到延長(zhǎng), 達(dá)到40 h^[49]。另一方面, 由于PEG的引入掩蓋了干擾素α與受體的結(jié)合, 降低了干擾素α的抗病毒活性, 因而先靈葆雅研究所對(duì)PEG的尺寸進(jìn)行考察, 最終確定PEG的大小為12 kDa可以在延長(zhǎng)半衰期的同時(shí)最大程度保留了干擾素α的抗病毒活性。因此, 采用PEG修飾策略要注意平衡半衰期和活性的關(guān)系。

圖 20 PEG modification to improve half-life of interferon-α

除了少數(shù)疏水肽, 大部分多肽都具有極性側(cè)鏈; 同時(shí), 多肽分子中的肽鍵可以與水分子形成氫鍵。因此, 大部分多肽都具有很好的水溶性。而多肽藥物必須透過(guò)細(xì)胞膜才能吸收入血, 發(fā)揮藥理學(xué)活性。因此, 必須要對(duì)多肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與改造, 提高肽類分子的滲透性, 以利于多肽分子進(jìn)入細(xì)胞, 發(fā)揮活性。提高肽類分子滲透性的方法包括引入鹵素原子、去除極性側(cè)鏈、手性策略、N-烷基化、高級(jí)脂肪酸修飾和其他方法等。

在小分子藥物的化學(xué)修飾中, 往往采用引入鹵素的修飾策略以提高小分子藥物的親脂性。在肽類分子的修飾改造中, 鹵素的引入也可以提高肽類分子的脂溶性。神經(jīng)多肽內(nèi)嗎啡肽具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性, 然而內(nèi)嗎啡肽57作為一種肽類分子, 很難通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦發(fā)揮藥效。通常藥物分子進(jìn)入血腦屏障需要一定的親脂性, 蘭州大學(xué)王銳等采用了引入鹵素原子的策略, 將2位脯氨酸變換為D-丙氨酸, 4位苯丙氨酸上引入鹵素以提高整體肽分子的脂溶性^[50], 通過(guò)該策略可以明顯提高內(nèi)嗎啡肽類似物的滲透性, 可以通過(guò)血腦屏障。內(nèi)嗎啡肽57的脂水分配系數(shù)D僅有12.5, 而引入鹵原子, 內(nèi)嗎啡肽類似物的D值上升至120, 提升了近9倍(圖 21)。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn), 腦實(shí)質(zhì)中檢測(cè)到了肽77, 進(jìn)一步驗(yàn)證了通過(guò)引入鹵素原子可以使肽類分子通過(guò)血腦屏障^[51]。

圖 21 Introduction of halogen to improve permeability of endomorphin

肽類分子中常含有極性的羧基片段, 這些富含谷氨酸和天冬氨酸的肽細(xì)胞滲透性比較差, 針對(duì)這類肽分子的改造一般采用去除極性側(cè)鏈的策略。一方面, 去除極性側(cè)鏈可以縮小肽分子的尺寸, 降低肽鏈多肽的性質(zhì), 使其更具有類似有機(jī)小分子的性質(zhì); 同時(shí)也可以改善肽類分子的細(xì)胞滲透性, 有利于其進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮藥效。比較典型的案例就是抗丙肝病毒藥物特拉匹韋的研發(fā)(圖 22)。Vertex公司早期發(fā)現(xiàn)了底物十肽78的活性為0.89 μmol·L^-1, 然而該化合物的分子量大, 需要首先對(duì)分子大小進(jìn)行優(yōu)化。研究人員考察了去除不同氨基酸片段對(duì)化合物抗病毒活性的影響, 研究表明去除P4'氨基酸片段對(duì)活性影響較大, 而去除P2'和P3'氨基酸片段對(duì)酶的親和力幾乎無(wú)影響。去除P5和P6兩個(gè)含有酸性側(cè)鏈的氨基酸片段, 活性明顯降低。另外, 去除P3和P4兩個(gè)疏水性氨基酸片段也會(huì)導(dǎo)致活性的下降。同時(shí)考慮到對(duì)絲氨酸蛋白酶的結(jié)合能力, 研究人員在C末端引入親電性的醛基作為彈頭, 得到了跨越S6~S1的六肽醛79, 其活性與底物十肽相同, 但是分子量顯著降低。

圖 22 Optimization of anti-HCV drug telaprevir

雖然P5和P6兩個(gè)酸性氨基酸片段對(duì)活性很重要, 但是由于兩個(gè)羧基的存在, 六肽醛79的極性很大, 不利于化合物進(jìn)入病毒感染的細(xì)胞, 因此下一步結(jié)構(gòu)改造的重點(diǎn)是提高分子的透膜性。研究人員進(jìn)一步切斷P5和P6兩個(gè)氨基酸片段, 并以雜環(huán)進(jìn)行替換得到四肽醛19, 其抗病毒活性明顯下降, 但是相比于底物十肽78, 分子量減小一半, 整個(gè)分子的成藥性更好^[52]。由于醛基的代謝性質(zhì)較差, 因此醛彈頭被其他彈頭替換得到酮酰胺化合物20, 其抗病毒活性與穩(wěn)定性俱佳, 至此, 肽類分子的透膜性問(wèn)題得以解決。

化合物20的活性仍有提高的空間, 因此研究人員對(duì)P1~P4片段進(jìn)行了系統(tǒng)性優(yōu)化。他們發(fā)現(xiàn)脯氨酸的疏水性基團(tuán)對(duì)酶的親和力影響很大, 因此首先對(duì)P2片段進(jìn)行改造, 通過(guò)比較不同的疏水基團(tuán)如醚、酯以及氨基甲酸酯等衍生物, 最后得到的含有四氫異喹啉氨基甲酸酯衍生物80, 其對(duì)NS3/4A酶的抑制活性提高至0.22 μmol·L^-1。進(jìn)一步優(yōu)化P1, 發(fā)現(xiàn)S1口袋僅能容納尺寸較小的疏水性基團(tuán), 最終確定乙基側(cè)鏈為最優(yōu); 同時(shí)優(yōu)化P3和P4, 得到的化合物81活性與80相當(dāng), 但是81的cLogP (5.5)更符合Linpinski五規(guī)則, 因而對(duì)81進(jìn)一步研究。將P2乙基側(cè)鏈與脯氨酸環(huán)化, 進(jìn)一步考察最終確定化合物82, 其對(duì)丙肝病毒NS3/4A蛋白酶的抑制活性為44 nmol·L^-1, 是一個(gè)活性很高的絲氨酸蛋白酶抑制劑, 被命名為特拉匹韋^[53]。特拉匹韋于2011年被FDA批準(zhǔn)上市, 用于治療丙型肝炎病毒感染。

環(huán)肽類化合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)與其理化性質(zhì)和藥理學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。北京大學(xué)深圳研究院李子剛等提出了一種假設(shè)——在約束肽的連接鏈上引入一個(gè)手性中心以改變肽類分子的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu), 從而影響肽類分子的透膜性。為驗(yàn)證這一策略的合理性, 他們?cè)O(shè)計(jì)合成了兩條FITC標(biāo)記的含有手性中心的環(huán)肽化合物83和84。由于手性中心的存在, 環(huán)肽83和84存在一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體, 分離出這些異構(gòu)體83a/b和84a/b并且將之與HEK293T細(xì)胞于37 ^oC共孵育2 h, 用熒光共聚焦顯微鏡成像(圖 23)。研究結(jié)果表明, 其中一種構(gòu)型的異構(gòu)體83b和84b可以穿入HEK293T細(xì)胞, 而另一構(gòu)型的異構(gòu)體83a和84a無(wú)法穿入細(xì)胞。說(shuō)明手性中心的引入可以使肽的螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 從而影響肽類分子的透膜性^[54]。

圖 23 Introduction of chiral center in cyclopeptide linker to change permeability of peptide. Figure derived from Hu K, et al[54]

N-烷基化的酰胺鍵往往可以改變肽類分子內(nèi)或分子間的氫鍵相互作用, 從而影響肽類分子的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變其物理化學(xué)性質(zhì)。柔性肽類分子中的分子內(nèi)氫鍵是被動(dòng)擴(kuò)散中的決定性因素。通過(guò)在特定的酰胺鍵進(jìn)行烷基化, 可以使肽類分子以最優(yōu)勢(shì)的構(gòu)象穿過(guò)細(xì)胞膜^[55]。Beck等^[56]對(duì)丙氨酸環(huán)六肽進(jìn)行N-甲基化修飾以考察N-甲基化對(duì)丙氨酸環(huán)六肽透膜性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在1, 5位、1, 6位或1, 2, 4, 5位酰胺氮原子進(jìn)行甲基化修飾可以明顯提高肽類分子對(duì)Caco-2細(xì)胞的滲透性, 其滲透性與對(duì)照睪酮(細(xì)胞透膜性標(biāo)志物)相當(dāng)。分析1, 6位N-甲基化修飾的環(huán)六肽的空間構(gòu)象發(fā)現(xiàn), 2位酰胺氫與5位酰胺羰基可以形成分子內(nèi)氫鍵, 而3位4位氨基酸所形成的β轉(zhuǎn)角也形成了分子內(nèi)氫鍵, 整個(gè)分子以疏水的構(gòu)象存在(圖 24), 因而細(xì)胞滲透性提高。

圖 24 N-alkylation to improve permeability of peptides. Figure derived from Beck JG, et al[56]

提高肽類分子透膜性的常用策略是對(duì)多肽進(jìn)行高級(jí)脂肪酸修飾。脂肪酸包括不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸, 目前有一些飽和脂肪酸修飾的多肽藥物已經(jīng)上市用于疾病的治療, 或者開發(fā)處于臨床研究階段。脂肪酸是構(gòu)成磷脂雙分子層以及人體脂肪的重要成分, 因此對(duì)多肽進(jìn)行脂肪酸修飾可以提高多肽與細(xì)胞膜表面的親和能力, 從而提高肽類分子的透膜性, 促進(jìn)上皮細(xì)胞對(duì)肽類分子的吸收。Hashizume等^[57]對(duì)胰島素分子的側(cè)鏈進(jìn)行棕櫚酸修飾, 棕櫚酸酰化胰島素的親脂性提高。研究人員用同位素標(biāo)記胰島素, 并通過(guò)測(cè)定給藥后6 h內(nèi)血漿中的放射性推斷胰島素在血漿中的含量。結(jié)果表明, 雙棕櫚酰胰島素的含量最高時(shí)是天然胰島素的6倍, 單棕櫚酰胰島素的含量是天然胰島素的3倍(圖 25)。這也說(shuō)明高級(jí)脂肪酸修飾可以提高肽類分子的透膜性。

圖 25 Introduction of fatty acid to improve the permeability of insulin. Figure derived from Hashizume M, et al[57]

除了化學(xué)方法, 某些制劑手段也可以影響肽類化合物的滲透和吸收。N-[8-(2-羥苯基)氨基]辛酸鈉(sodium N-[8-(2-hydroxybenzyl)amino]caprylate, SNAC)是由Emisphere開發(fā)的一種基于各種促吸收劑的大分子遞送技術(shù)。SNAC能夠遞送0.5~150 kDa的大分子, 且不會(huì)影響大分子的高級(jí)結(jié)構(gòu), 不影響藥物釋放。同時(shí)SNAC還具有很高的安全性, 不影響胃腸黏膜結(jié)構(gòu)。

吸收促進(jìn)劑與藥物分子存在較弱的非共價(jià)相互作用, 可形成暫時(shí)穩(wěn)定的中間體。促進(jìn)劑一般是疏水性物質(zhì), 通過(guò)與藥物分子相互作用形成的藥物促進(jìn)劑復(fù)合體具有更強(qiáng)的親脂性, 從而促進(jìn)藥物分子透過(guò)上皮細(xì)胞膜。由于復(fù)合體只存在較弱的非共價(jià)相互作用, 隨著復(fù)合物透過(guò)細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán), 藥物與促進(jìn)劑解離釋放出藥物(圖 26)^[58]。

圖 26 Mechanism of absorption enhancer. Figure derived from Arbit E, et al[58]

2017年, 諾和諾德便宣布FDA批準(zhǔn)了索馬魯肽改善II型糖尿病患者的血糖控制。雖然索馬魯肽是長(zhǎng)效的GLP-1激動(dòng)劑, 但糖尿病患者仍需每周注射一次。為了提高患者的依從性, 諾和諾德很早就開始了口服索馬魯肽的研究。研究人員將索馬魯肽與吸收促進(jìn)劑SNAC制成口服配方。SNAC與索馬魯肽結(jié)合使得其在胃部吸收, 而且溶解的SNAC在胃部形成局部相對(duì)較高的pH環(huán)境, 既可以增加索馬魯肽的溶解度, 在該環(huán)境下索馬魯肽受胃肽酶的影響很小, 又促進(jìn)了索馬魯肽的吸收^[59]。從圖 27中可以看出, 口服索馬魯肽在胃部可以充分吸收并快速釋放。2019年9月20日, 口服索馬魯肽被FDA批準(zhǔn)用于結(jié)合飲食和運(yùn)動(dòng)以改善II型糖尿病患者的血糖控制。

圖 27 Absorption and release of oral semaglutide. Figure derived from Knudsen LB, et al[59]

含有疏水側(cè)鏈的多肽往往水溶性較差, 而含有極性側(cè)鏈的多肽水溶性相對(duì)較好。不同的多肽因其組成不同而具有不同的溶解性。有些臨床使用的多肽藥物常常含有芳香性氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸等, 但是這類含有芳香性氨基酸的多肽常常溶解性很差。胰高血糖素含有半數(shù)以上疏水性側(cè)鏈, 且含有多個(gè)芳香性氨基酸, 因此, 其在水溶液中溶解性差。

臨床上通常使用胰高血糖素治療急性低血糖。臨床使用的胰高血糖素通常以凍干粉末的形式保存, 使用時(shí)需要用無(wú)菌酸性溶劑溶解, 但溶解時(shí)常常產(chǎn)生不溶性纖維^[60, 61]。因此, 通過(guò)合適的修飾改造策略提高胰高血糖素的溶解性對(duì)胰高血糖素的臨床使用有重要意義。天然的胰高血糖素85在PBS中的溶解度很小, Morz等^[62]將胰高血糖素中的苯丙氨酸或酪氨酸替換為吡啶基丙氨酸3-pal或4-pal, 尤其是多個(gè)位點(diǎn)替換(表 5), 得到的肽在PBS溶液中的溶解性有了一定程度提高, 其中肽87和88, 在保持胰高血糖素活性的同時(shí), 溶解度提高, 大于15 mg·mL^-1。這也表明引入吡啶基團(tuán)可以提高多肽分子的水溶性。Mayer等^[63]也報(bào)道了利用吡啶基替換苯丙氨酸或酪氨酸中的苯環(huán)以提高多肽類降鈣素基因相關(guān)肽受體拮抗劑的水溶性。

表 5 Replacing Phe/Tyr with pyridine motif to improve water-solubility of glucagon (Aib, aminoisobutyric acid)

隨著全球小分子藥物研發(fā)的難度增加以及生物大分子藥物研發(fā)速度的不斷加快, 介于兩者之間的多肽類藥物也成為全球制藥公司關(guān)注的焦點(diǎn), 多肽藥物的銷售額也在逐年穩(wěn)步上升。目前全球批準(zhǔn)上市的多肽藥物已超過(guò)80多種, 進(jìn)入臨床的多肽分子數(shù)量也在不斷增加, 疾病領(lǐng)域涉及腫瘤、代謝性疾病、感染性疾病、免疫、心血管疾病以及泌尿生殖系統(tǒng)疾病等, 其中還有諸如甘精胰島素和利拉魯肽這種重磅炸彈級(jí)的多肽藥物, 因此多肽藥物的前景非常廣闊。

多肽藥物均衡了小分子藥物和生物藥的優(yōu)點(diǎn), 具有活性強(qiáng)、選擇性好、安全性高, 不容易在體內(nèi)蓄積、與其他藥物相互作用少、代謝途徑可預(yù)測(cè)等優(yōu)點(diǎn), 是一類理想的可用于開發(fā)成為藥物的先導(dǎo)化合物。然而多肽藥物本身也存在著半衰期短、血漿清除率高、不容易透過(guò)細(xì)胞膜、大多數(shù)藥物不能口服, 通常需要注射給藥, 患者依從性差以及生產(chǎn)成本較高等問(wèn)題, 這些問(wèn)題制約了多肽類藥物的發(fā)展。采用多種化學(xué)修飾策略如末端結(jié)構(gòu)修飾、拼接策略、環(huán)化策略、非天然氨基酸修飾、偽肽策略以及膽固醇修飾等可以提高肽類分子的活性; 除了上述部分方法可以提高肽的穩(wěn)定性, 還可采用逆肽策略以及高級(jí)脂肪酸修飾、蛋白融合策略、聚乙二醇修飾等策略提高肽類分子的代謝穩(wěn)定性; 采用引入鹵素原子、去除極性側(cè)鏈、手性策略、N-烷基化、高級(jí)脂肪酸修飾等策略可以改善肽類分子的滲透性。許多成功上市的多肽藥物都用到了這些改造策略中的一種或幾種。

目前, 通過(guò)對(duì)肽類分子的修飾和改造解決多肽藥物的缺點(diǎn), 仍然是最直接和有效的策略。熟悉了解多肽藥物的基本改造策略, 對(duì)于多肽類藥物的研究和開發(fā)具有重要意義。雖然多肽藥物的發(fā)展仍然面臨著一些挑戰(zhàn), 但隨著未來(lái)藥物化學(xué)改造策略的完善以及新型藥物遞送系統(tǒng)以及吸收促進(jìn)劑的不斷發(fā)展, 這些技術(shù)都將會(huì)應(yīng)用到多肽藥物的開發(fā)之中, 為多肽藥物的開發(fā)提供更合理更豐富的思路。