含酪氨酸硫酸化修飾的芋螺毒素的高效合成方法及表征

李長(zhǎng)鵬

華南理工大學(xué)

DOI：   10.27151/d.cnki.ghnlu.2020.004589

摘要：蛋白質(zhì)酪氨酸硫酸化(Sulfotyrosine,sY)是一種普遍存在于生物體內(nèi)的翻譯后修飾。多數(shù)硫酸化蛋白質(zhì)會(huì)參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)從而影響生理功能如止血、白細(xì)胞黏附等,其中有部分PPI過(guò)程是通過(guò)識(shí)別酪氨酸上的硫酸根來(lái)參與,因此,sY與蛋白生物活性的關(guān)系備受關(guān)注。當(dāng)前較普遍采用的策略是通過(guò)新戊基(Neopentyl,nP)來(lái)對(duì)硫酸根進(jìn)行保護(hù)從而防止其在多肽合成中水解,但目前合成的多數(shù)硫酸化多肽其序列不含半胱氨酸(Cys)殘基,這與其側(cè)鏈巰基在nP脫除條件下不穩(wěn)定有關(guān)。然而,Cys存在于多數(shù)重要生理蛋白/多肽中,因此有必要開(kāi)發(fā)一種更為普適的、含半胱氨酸的硫酸化修飾多肽合成方法來(lái)推動(dòng)相關(guān)多肽/蛋白藥物的基礎(chǔ)研究。芋螺毒素被譽(yù)為“海洋藥物寶庫(kù)”,其藥用活性已經(jīng)成為當(dāng)今國(guó)際生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。α4/7-芋螺毒素一般由15-22個(gè)氨基酸組成且包含4個(gè)Cys,因其能特異性阻斷神經(jīng)型乙酰膽堿受體而被認(rèn)為是極具潛力的神經(jīng)性疾病藥物。此前有研究人員通過(guò)質(zhì)譜手段發(fā)現(xiàn)部分α4/7-芋螺毒素存在sY修飾,但由于難以獲取均一硫酸化多肽而導(dǎo)致其活性及相關(guān)研究并未能順利開(kāi)展。在本論文工作中,我們對(duì)sY的保護(hù)基nP的脫除方法進(jìn)行了一系列探索,最終得到了其保護(hù)基脫除的一般性規(guī)律,認(rèn)為nP在大多數(shù)水溶液中均可脫除。我們將該方法應(yīng)用于8條硫酸化α4/7-芋螺毒素的合成:通過(guò)Fmoc-SPPS策略制備得到線(xiàn)性多肽,以分步、選擇性的方法對(duì)多肽進(jìn)行定向折疊,在折疊的同時(shí)完成nP基團(tuán)的脫除,實(shí)現(xiàn)一鍋法高效制備含sY的目標(biāo)多肽。并且,我們也成功避免了硫酸根在酸性條件下的水解問(wèn)題,最終利用常規(guī)HPLC制備得到含sY修飾的芋螺毒素。通過(guò)動(dòng)物血清實(shí)驗(yàn)表明了多肽在血清中具有良好的穩(wěn)定性且sY修飾不會(huì)降低多肽的穩(wěn)定性。最后,為了探究sY修飾對(duì)于芋螺毒素與乙酰膽堿結(jié)合蛋白相互作用的影響,我們對(duì)乙酰膽堿結(jié)合蛋白的重組表達(dá)進(jìn)行了初試,但發(fā)現(xiàn)該蛋白在透析復(fù)性以及蛋白酶切過(guò)程中極易多聚且不可控?？偟膩?lái)說(shuō),我們開(kāi)發(fā)了一種高效的含半胱氨酸的硫酸化多肽的合成方法來(lái)推動(dòng)硫酸化多肽/蛋白的合成研究,并為硫酸化修飾多肽/蛋白的藥用機(jī)理研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 

關(guān)鍵詞：      酪氨酸硫酸化修飾;多肽合成;多肽折疊;新戊基的脫除;芋螺毒素;乙酰膽堿結(jié)合蛋白;

專(zhuān)輯：   工程科技Ⅰ輯

專(zhuān)題：   有機(jī)化工

DOI：   10.27151/d.cnki.ghnlu.2020.004589

分類(lèi)號(hào)：      TQ464

導(dǎo)師：   何春茂;

學(xué)科專(zhuān)業(yè)：   分析化學(xué)

碩士電子期刊出版信息： 年期：2021年第02期網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2021-01-16——2021-02-15

 含酪氨酸硫酸化修飾的芋螺毒素的高效合成方法及表征|李長(zhǎng)鵬|華南理工大學(xué)

 酪氨酸硫酸化修飾|多肽合成|多肽折疊|新戊基的脫除|芋螺毒素|乙酰膽堿結(jié)合蛋白

 

文章目錄
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 芋螺毒素
        1.2.1 芋螺毒素的折疊研究
        1.2.2 芋螺毒素類(lèi)似物和突變體研究
        1.2.3 α4/7-芋螺毒素與硫酸化酪氨酸
    1.3 乙酰膽堿結(jié)合蛋白
    1.4 酪氨酸硫酸化(sY)修飾
        1.4.1 酪氨酸硫酸化修飾的生理學(xué)作用
        1.4.2 酪氨酸硫酸化修飾的檢測(cè)和預(yù)測(cè)
        1.4.3 含硫酸化的蛋白質(zhì)/多肽的制備方法
    1.5 固相多肽合成(SPPS)
        1.5.1 SPPS策略
        1.5.2 SPPS試劑以及純化方法的選擇
    1.6 本文的研究?jī)?nèi)容與研究意義
        1.6.1 研究?jī)?nèi)容
        1.6.2 研究意義
第二章 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的合成以及脫保護(hù)
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)原料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.3 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH的合成
        2.2.4 nP保護(hù)基脫除條件篩選
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 Fmoc-Tyr(OSO3nP)-OH合成表征
        2.3.2 保護(hù)基脫除結(jié)果
    2.4 本章小結(jié)
第三章 α4/7-芋螺毒素的化學(xué)合成
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)原料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.3 不含sY芋螺毒素的合成以及折疊
        3.2.4 含sY芋螺毒素的合成以及折疊
        3.2.5 血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 多肽分離和富集純化
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 合成方法的探究
        3.3.2 α4/7-芋螺毒素的合成與折疊
        3.3.3 圓二色光譜
        3.3.4 芋螺毒素血清穩(wěn)定性
    3.4 本章小結(jié)
第四章 乙酰膽堿結(jié)合蛋白表達(dá)方法的探究
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)原料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.3 His6-SUMO-Ac-ACh BP的包涵體表達(dá)
        4.2.4 蛋白質(zhì)復(fù)性和酶切條件的探究
        4.2.5 蛋白質(zhì)分析與純化方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)條件篩選
        4.3.2 復(fù)性,酶切以及純化
    4.4 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件

含酪氨酸硫酸化修飾的芋螺毒素的高效合成方法及表征|李長(zhǎng)鵬|華南理工大學(xué)

 酪氨酸硫酸化修飾|多肽合成|多肽折疊|新戊基的脫除|芋螺毒素|乙酰膽堿結(jié)合蛋白