以賴氨酸、糖等為砌塊構(gòu)建新型陽離子大分子及其應用研究
孫景景
中國科學院大學
摘要：本論文主要以賴氨酸、聚乳酸、半乳糖等天然產(chǎn)物為砌塊，設計、合成了系列新型結(jié)構(gòu)規(guī)整的陽離子功能大分子，研究了其作為基因輸送載體的應用，進而探索載體大分子結(jié)構(gòu)與組成對其基因輸送性能及相關(guān)細胞輸送機制的影響規(guī)律。與此同時，采用pH和還原響應性砌塊，設計制備了具有雙重環(huán)境響應性的殼交聯(lián)大分子膠束，研究了其在水溶液中的環(huán)境響應性質(zhì)及其作為智能藥物輸送載體的應用。具體研究內(nèi)容主要包括以下五個部分: 一、含賴氨酸的甲基丙烯酸酯類陽離子大分子PHML的合成、表征以及RAFT聚合反應動力學研究 以天然賴氨酸為功能砌塊，設計合成制備了含Boc-賴氨酸的甲基丙烯酸酯類單體HEMA-Boc-Lys，進一步采用RAFT聚合法，活性聚合制備得到系列分子量的PHML-Boc大分子，并考察了其RAFT聚合反應動力學。在此基礎上，通過脫除Boc保護基，制備得到新型水溶性陽離子大分子PHML，并運用1H NMR、GPC和FT-IR等手段對其大分子結(jié)構(gòu)進行了表征。研究結(jié)果表明制備所得的PHML系列大分子(6K、10K、15K、23K和30K)結(jié)構(gòu)規(guī)整，且分子量易調(diào)控，為進一步深入研究PHML大分子結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系提供了基礎?！ 《?、新型陽離子功能大分子PHML作為基因載體的應用及相關(guān)細胞內(nèi)輸送機制的研究 以上述制備所得陽離子大分子PHML為非病毒基因載體，運用酸堿滴定、瓊脂糖凝膠電泳、動態(tài)光散射(DLS)、透射電子顯微鏡(TEM)等分析表征手段，研究了PHML的溶液質(zhì)子緩沖能力、pDNA結(jié)合力以及PHML/pDNA復合物的尺度、表面電勢和形貌。分別采用CCK-8和乳酸脫氫酶(LDH)評價方法，研究了PHML載體的體外細胞毒性和細胞膜破壞力。進一步采用熒光素酶(luciferase)編碼基因、綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因和p53基因為報告基因，研究了PHML載體/pDNA復合物在多種細胞系中的基因轉(zhuǎn)染行為。并運用流式細胞術(shù)、細胞內(nèi)吞途徑選擇性抑制和細胞內(nèi)熒光共定位等方法研究了PHML/pDNA復合物的細胞內(nèi)吞效率、內(nèi)吞途徑及胞內(nèi)輸送機制。研究結(jié)果表明，隨著分子量的增加，PHML載體的pDNA結(jié)合力、基因轉(zhuǎn)染效率以及相關(guān)pDNA復合物的細胞內(nèi)吞效率趨于增強。與商業(yè)化線性聚賴氨酸PLL(15-30K)載體相比，PHML-30K載體呈現(xiàn)更低的細胞毒性、更佳的基因轉(zhuǎn)染效率和更高的復合物細胞內(nèi)吞效率。此外，通過調(diào)節(jié)PHML載體的分子量可調(diào)控其pDNA復合物的細胞內(nèi)吞途徑，PHML-30K/pDNA復合物主要通過陷穴小泡(caveolae)介導的內(nèi)吞和微管途徑遷移進入細胞，并且具有內(nèi)涵體逃逸及釋放的pDNA繞核分布現(xiàn)象?！ ∪⑸锟山到馊抖喂簿鄞蠓肿覲HML-b-PLLA-b-PHML的合成、自組裝及其作為基因輸送載體的應用研究 采用開環(huán)聚合(ROP)和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)方法合成制備了系列結(jié)構(gòu)規(guī)整的生物可降解三嵌段共聚大分子PHMLn-b-PLLA22-b-PHMLn(n=17，24，30)，并進一步將其溶于水，制備了兩親嵌段大分子膠束PHML-b-PLLA-b-PHMLNP。運用瓊脂糖凝膠電泳和脫氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)酶解法研究了PHML-b-PLLA-b-PHML NP的pDNA結(jié)合力及其pDNA復合物的抗酶解穩(wěn)定性。進一步運用DLS和原子力顯微鏡(AFM)研究了陽離子大分子膠束PHML-b-PLLA-b-PHML NP及其pDNA復合物的尺寸、表面電勢及形貌。在此基礎上，以PHML-b-PLLA-b-PHML NP為基因載體，研究了其H1299細胞毒性、基因轉(zhuǎn)染及相關(guān)復合物的細胞內(nèi)吞途徑。研究結(jié)果表明，PHML-b-PLLA-b-PHMLNP具有較低的細胞毒性和較高的pDNA結(jié)合力，并能夠有效地保護pDNA避免被核酸酶降解。在10％FBS的存在下，PHML-b-PLLA-b-PHML NP載體呈現(xiàn)接近于bPEI-25K對比參照的基因轉(zhuǎn)染效率。此外，PHML30-b-PLLA22-b-PHML30NP載體負載pDNA通過脂筏途徑內(nèi)吞進入細胞，與病毒載體的細胞內(nèi)吞途徑具有相似性?！ ∷?、具有側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的新型陽離子大分子的制各及其作為基因輸送載體的研究 采用RAFT聚合法合成制備了系列結(jié)構(gòu)規(guī)整的具有側(cè)掛天然賴氨酸和半乳糖的陽離子大分子PHML-b-PMAGal和P(HML-st-MAGal)。運用瓊脂糖凝膠電泳、DLS、TEM等分析表征方法，研究了系列陽離子大分子的pDNA結(jié)合力及其pDNA復合物的尺寸、表面電勢和形貌。以系列陽離子大分子為基因載體，運用MTT法和熒光素酶法研究了其細胞毒性和基因轉(zhuǎn)染行為。結(jié)果表明，PHML-b-PMAGal和P(HML-st-MAGal)大分子載體的細胞毒性和基因轉(zhuǎn)染效率與其大分子的共聚單元序列結(jié)構(gòu)和半乳糖的含量密切相關(guān)。在系列所得大分子載體中，半乳糖含量為4.8％的P(HML40-st-MAGal4)載體在10％ FBS存在下，H1299細胞基因轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)，且在多種細胞系中均呈現(xiàn)高于bPEI-25K載體參照的基因轉(zhuǎn)染效率?！ ∵M一步以實驗中呈現(xiàn)最優(yōu)基因轉(zhuǎn)染的P(HML40-st-MAGal4)載體為研究對象，采用流式細胞術(shù)、細胞內(nèi)吞途徑選擇性抑制和熒光共定位方法，研究了載體/pDNA復合物在10％FBS下的細胞內(nèi)吞效率、內(nèi)吞途徑及胞內(nèi)輸送機制。研究結(jié)果表明10％FBS的存在沒有改變P(HML40-st-MAGal4)/pDNA復合物的細胞內(nèi)吞途徑，但改變了復合物經(jīng)由不同內(nèi)吞途徑被細胞所攝取的比例，這可能是其在10％FBS下細胞內(nèi)吞效率和基因轉(zhuǎn)染效率增加的原因。此外，P(HML40-st-MAGal4)/p DNA復合物在10％FBS下仍具有較強的內(nèi)涵體逃逸能力，且逃逸的pDNA能夠快速遷移進入細胞核內(nèi)?！ ∥?、雙重環(huán)境響應性殼交聯(lián)大分子膠束的制備及其作為藥物輸送載體的研究 采用RAFT聚合法合成制備了系列結(jié)構(gòu)規(guī)整的兩嵌段三組分共聚大分子PDPA-b-P(NMS-co-OEG)，并運用溶液自組裝法制備了尺寸為30～90 nm的大分子膠束。在此基礎上，進一步采用胱胺交聯(lián)劑，制備了P DPA-b-P(NMS-co-OEG)殼交聯(lián)大分子膠束，并運用DLS、TEM、1H NMR、熒光光譜法研究了殼交聯(lián)大分子膠束的尺寸、形貌及環(huán)境響應性質(zhì)。結(jié)果表明PDPA33-b-P(NMS22-co-OEG25)殼交聯(lián)大分子膠束具有pH和還原雙重環(huán)境響應性，在酸性條件下疏水內(nèi)核發(fā)生溶脹，在10 mM GSH的存在下交聯(lián)殼層發(fā)生反應解交聯(lián)，當同時在酸性條件和10 mM GSH的存在下時，大分子膠束發(fā)生解離轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂??！ ∵M一步以喜樹堿(CPT)為疏水藥物模型，研究了PDPA33-b-P(NMS22-co-OEG25)未交聯(lián)和殼交聯(lián)大分子膠束對藥物的負載能力及載藥膠束的CPT體外釋放行為，并考察了其作為藥物載體的細胞毒性。結(jié)果表明，PDPA33-b-P(NM S22-co-OEG25)未交聯(lián)及殼交聯(lián)大分子膠束對H1299細胞無明顯毒性。通過殼交聯(lián)，大分子膠束的載藥量和包封率顯著增加，在pH=7.4下的CPT釋放速度顯著降低。此外，酸性或/和還原性環(huán)境均能夠單獨或協(xié)同促進PDPA33-b-P(NMS22-co-OEG25)殼交聯(lián)載藥大分子膠束的CPT釋放。
關(guān)鍵詞：陽離子 大分子 賴氨酸 聚乳酸 半乳糖 合成工藝 基因輸送性能
授予學位：博士
學科專業(yè)：高分子化學與物理
導師姓名：曹阿民
學位年度：2014
語種：中文
分類號：TQ460.6(制藥化學工業(yè))
以賴氨酸、糖等為砌塊構(gòu)建新型陽離子大分子及其應用研究|孫景景|中國科學院大學
陽離子|大分子|賴氨酸|聚乳酸|半乳糖|合成工藝|基因輸送性能
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摘要
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專業(yè)名稱縮寫一覽表
第一章 前言
第一節(jié) 研究背景
第二節(jié) 本論文的工作設想
參考文獻
第二章 含賴氨酸的甲基丙烯酸酯類陽離子大分子PHML的合成、結(jié)構(gòu)表征以及RAFT聚合反應動力學研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) 含賴氨酸的甲基丙烯酸酯功能單體及RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑的合成與結(jié)構(gòu)表征
第三節(jié) 含賴氨酸的甲基丙烯酸酯單體的RAFT聚合反應動力學研究
第四節(jié) RAFT聚合制備含賴氨酸側(cè)基的陽離子功能大分子及其結(jié)構(gòu)表征
本章小結(jié)
實驗部分
參考文獻
第三章 新型陽離子功能大分子PHML作為基因載體的應用及細胞內(nèi)輸送機制的研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) 陽離子大分子PHML的質(zhì)子緩沖性能和pDNA結(jié)合力研究
第三節(jié) 陽離子大分子PHML／pDNA復合物的表征研究
第四節(jié) 陽離子大分子PHML的HeLa細胞毒性及其介導的基因轉(zhuǎn)染研究
第五節(jié) PHML陽離子大分子載體在其它細胞系的基因轉(zhuǎn)染研究
第六節(jié) 陽離子大分子PHML／pDNA復合物的細胞轉(zhuǎn)運機制的研究
本章小結(jié)
實驗部分
參考文獻
第四章 生物可降解三嵌段共聚大分子PHML-b-PLLA-b-PHML的合成、自組裝及其作為基因輸送載體的研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) PHML-b-PLLA-b-PHML三嵌段共聚大分子的合成與結(jié)構(gòu)表征
第三節(jié) 兩親三嵌段共聚大分子PHML-b-PLLA-b-PHML自組裝膠束的研究
第四節(jié) PHML-b-PLLA-b-PHML NP／pDNA復合物的表征研究
第五節(jié) PHML-b-PLLA-b-PHML大分子及PHML-b-PLLA-b-PHML NP／pDNA復合物的細胞毒性研究
第六節(jié) PHML-b-PLLA-b-PHML NP／pDNA復合物的H1299細胞基因轉(zhuǎn)染及內(nèi)吞機制研究
本章小結(jié)
實驗部分
參考文獻
第五章 側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的新型陽離子大分子的制備及其作為基因輸送載體的研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) 側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的陽離子大分子的合成與結(jié)構(gòu)表征
第三節(jié) 側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的新型陽離子大分子／pDNA復合物的表征研究
第四節(jié) 側(cè)掛半乳糖和賴氨酸的新型陽離子大分子作多基因輸送載體的研究
第五節(jié) 含半乳糖陽離子大分子P(HML40-st-MAGal4)／pDNA復合物的細胞輸運機制的研究
本章小結(jié)
實驗部分
參考文獻
第六章 雙重響應性殼交聯(lián)膠束的制備及其作為藥物輸送載體的應用研究
第一節(jié) 引言
第二節(jié) PDPA-b-P(NMS-co-OEG)共聚大分子的合成與結(jié)構(gòu)表征
第三節(jié) PDPA-b-P(NMS-co-OEG)大分子自組裝膠束及殼交聯(lián)膠束的制備與表征
第四節(jié) PDPA-b-P(NMS-co-OEG)大分子膠束及殼交聯(lián)膠束的環(huán)境響應性研究
第五節(jié) PDPA-b-P(NMS-co-OEG)溶液自組裝大分子膠束及其殼交聯(lián)膠束作為藥物輸送載體的研究
本章小結(jié)
實驗部分
參考文獻
全文總結(jié)與展望
全文總結(jié)
今后進一步工作的展望
附錄
作者簡介及在學期間發(fā)表的學術(shù)論文
以賴氨酸、糖等為砌塊構(gòu)建新型陽離子大分子及其應用研究|孫景景|中國科學院大學
陽離子|大分子|賴氨酸|聚乳酸|半乳糖|合成工藝|基因輸送性能
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