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任麗萍 范慧紅
中國食品藥品檢定研究院,國家藥品監(jiān)督管理局化學(xué)藥品質(zhì)量研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
摘要：目的：為合成肽類藥物的研究和質(zhì)量控制提供參考。方法：從合成肽類藥物的定義和分類入手，分析梳理合成肽類藥物相關(guān)指導(dǎo)原則及不同藥典中與其相關(guān)的通用技術(shù)要求現(xiàn)狀。結(jié)果與結(jié)論：與傳統(tǒng)藥物相比，合成肽類藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，質(zhì)量屬性分析方法的建立具有更大的難度和特殊性，質(zhì)量控制的要點(diǎn)在于藥物活性成分的結(jié)構(gòu)表征、肽相關(guān)雜質(zhì)的控制與分析和質(zhì)量控制用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。
關(guān)鍵詞：多肽;化學(xué)合成肽;質(zhì)量控制;肽相關(guān)雜質(zhì);
基金資助：合成肽類創(chuàng)新藥聚合物雜質(zhì)關(guān)鍵分析技術(shù)研究（編號2023HYZX01）；
DOI：10.16153/j.1002-7777.2023.08.010 中國藥事. 2023,37(08)
合成肽類藥物的質(zhì)量控制
摘要 目的：為合成肽類藥物的研究和質(zhì)量控制提供參考。方法：從合成肽類藥物的定義和分類入手，分析梳理合成肽類藥物相關(guān)指導(dǎo)原則及不同藥典中與其相關(guān)的通用技術(shù)要求現(xiàn)狀。結(jié)果與結(jié)論：與傳統(tǒng)藥物相比，合成肽類藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，質(zhì)量屬性分析方法的建立具有更大的難度和特殊性，質(zhì)量控制的要點(diǎn)在于藥物活性成分的結(jié)構(gòu)表征、肽相關(guān)雜質(zhì)的控制與分析和質(zhì)量控制用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。
肽類藥物是由兩個(gè)或多個(gè)α-氨基酸通過肽鍵連接而成。合成肽類藥物是指由化學(xué)合成方法制備的肽類藥物。開發(fā)安全性高、療效好的合成肽類藥物有賴于起始原料的質(zhì)量控制、肽的固相合成策略以及分離純化技術(shù)等多方面的共同發(fā)展。對藥物質(zhì)量控制的廣義理解包括藥品起始原料供應(yīng)商的質(zhì)量控制、藥品生產(chǎn)過程控制以及終產(chǎn)品的質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。合成肽類藥物的生產(chǎn)過程包括合成肽起始物料的控制，肽合成過程中的偶聯(lián)和脫保護(hù)反應(yīng)參數(shù)的確定，合成工藝中裂解、修飾、純化過程以及凍干成鹽工藝的確定等。鑒于多篇文獻(xiàn)都曾對合成肽類藥物的制備工藝和過程控制進(jìn)行過專門的闡述與說明，本文將主要側(cè)重于梳理合成肽類藥物的定義與分類，總結(jié)分析國內(nèi)外合成肽類藥物質(zhì)量控制要求的最新進(jìn)展，結(jié)合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核過程中的體會(huì)與思考，就合成肽類藥物質(zhì)量控制的要點(diǎn)進(jìn)行分析探討。多肽在包括細(xì)胞增殖分化、免疫防御、腫瘤病變等在內(nèi)的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。從多肽藥物的獲取途徑來講，共有化學(xué)合成肽、從天然產(chǎn)物中提取的肽和基因重組技術(shù)多肽三種。因?yàn)樵谒幬锷陥?bào)過程中，生物制品與化學(xué)藥品遵循著不同的毒理學(xué)指南和質(zhì)量研究指南，因此，產(chǎn)品的監(jiān)管定義和分類對于肽類藥物開發(fā)者至關(guān)重要。盡管隨著固相合成技術(shù)的發(fā)展，化學(xué)合成的肽鏈的長度已能超過50個(gè)氨基酸，但對于如何從肽鏈的長短或是肽鏈的數(shù)量來劃分肽與蛋白質(zhì)，目前還缺乏統(tǒng)一的科學(xué)共識。2020年2月，美國食品和藥物管理局（FDA）發(fā)布聯(lián)邦公報(bào)[1]，規(guī)定“蛋白”是α-氨基酸的聚合物，這類聚合物具有特定的、明確定義的氨基酸序列，所包含的氨基酸的數(shù)目應(yīng)超過40個(gè)。當(dāng)有兩條或兩條以上的氨基酸鏈在聚合物中互相連接時(shí)，氨基酸聚合物的大小指的是所有鏈中氨基酸的數(shù)目，并非單指以連續(xù)的順序所連接的氨基酸的數(shù)目，以上規(guī)定減少了監(jiān)管部門將肽和蛋白質(zhì)作為藥品或是生物制品劃分的不確定性?；谶@一規(guī)定，美國藥典（USP）1503通則[2]明確了肽的定義：肽是由兩個(gè)或更多的氨基酸通過共價(jià)連接的短鏈，可由重組技術(shù)、生物提取或化學(xué)合成制備。并規(guī)定小于等于40個(gè)氨基酸組成的聚合物為肽，同時(shí)說明除非還同時(shí)滿足生物制品的定義（如為肽類疫苗），否則的話應(yīng)當(dāng)視為藥品而不是生物制品。美國藥典1503通則明確規(guī)定該通則中所描述的概念和質(zhì)量要求只適用于化學(xué)合成的肽。我國2007年發(fā)布的合成多肽藥物藥學(xué)研究指導(dǎo)原則針對的也是化學(xué)合成肽[3]。在其前言中定義了合成多肽藥物是指采用化學(xué)合成方法制備的多肽類藥物，明確指導(dǎo)原則的適用范圍是采用液相或固相合成方法制備的多肽藥物，并不涵蓋采用生物技術(shù)（重組技術(shù)或發(fā)酵工藝）或動(dòng)植物提取的多肽藥物。與美國藥典通則有所不同的是，指導(dǎo)原則全文中未見對于氨基酸殘基數(shù)目范圍的規(guī)定。雖然在結(jié)構(gòu)確證研究將合成肽分短肽、中肽和長肽進(jìn)行分別敘述，但如何進(jìn)行界定，指導(dǎo)原則并未給出準(zhǔn)確定義。特別值得關(guān)注的是，2023年2月21日，國家藥品監(jiān)督管理局最新公布了《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[4]。在前言中明確了多肽是由多個(gè)氨基酸通過酰胺鍵相連形成的化合物，可通過基因重組表達(dá)、生物提取、化學(xué)合成等方法制備。這一版指導(dǎo)原則也未對肽鏈中氨基酸的數(shù)目和肽鏈的長短進(jìn)行規(guī)定，在結(jié)構(gòu)確證研究中也不再將其分為短肽、中肽和長肽，而是從一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行討論。2 合成肽類藥物相關(guān)指導(dǎo)原則及通用技術(shù)要求由于分子大小介于小分子藥物和大分子藥物之間，合成肽類藥物研發(fā)原則上應(yīng)遵循一般的研究指南[5-6]。近年來，隨著進(jìn)入臨床開發(fā)和市場的肽類藥物顯著增多和合成肽類藥物質(zhì)控理念的不斷提升，更多國家和地區(qū)的藥品監(jiān)管部門，先后出臺或更新了許多有關(guān)合成肽類藥物研究的通用技術(shù)要求或指導(dǎo)原則。相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]表明，在肽治療領(lǐng)域工作的行業(yè)和監(jiān)管科學(xué)家們正在對肽類治療藥物的研究進(jìn)展、多肽藥物開發(fā)和安全性評估所面臨的復(fù)雜挑戰(zhàn)以及肽類藥物治療前景等一系列相關(guān)問題進(jìn)行著更深入的討論和研究，本節(jié)內(nèi)容并不涉及毒理學(xué)、遺傳毒性或免疫原性評估等非臨床安全性評價(jià)內(nèi)容，主要側(cè)重藥學(xué)質(zhì)量研究的相關(guān)指導(dǎo)原則和技術(shù)要求。FDA是第一個(gè)發(fā)布有關(guān)合成肽研究指南的監(jiān)管機(jī)構(gòu)，1994年發(fā)布了合成肽化學(xué)、制造和控制信息提交的行業(yè)指南[10]。該指南提供了一系列在制造過程中控制純度的方法，以確保終產(chǎn)品的質(zhì)量。但該指南于2006年被FDA官方撤回。2013年，USP成立了一個(gè)治療性肽專家小組，負(fù)責(zé)解決與肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)的重要問題，召集合適的專家研究討論藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定近年來，美國藥典中與合成肽相關(guān)的技術(shù)要求更新最快，目前美國藥典收載的合成肽類藥物各論和與多肽藥物相關(guān)的研究通則最多[11]。與肽類藥物研究相關(guān)的通則共有5個(gè)，分別為肽中的醋酸測定法（503）[12]、肽中的三氟醋酸測定（503.1）[13]、生物技術(shù)產(chǎn)品的氨基酸分析（1052）[14]、生物技術(shù)產(chǎn)品的肽圖分析（1055）[15]和合成肽類藥物的質(zhì)量屬性（1503）。其中，通則1503草案最先于2019年發(fā)布于美國藥典論壇征求意見，2021年8月生效。該通則根據(jù)FDA的監(jiān)管要求，概述了起草的詳細(xì)背景、合成肽研發(fā)所應(yīng)具有的最低質(zhì)量屬性，僅對化學(xué)合成肽原料藥的質(zhì)量屬性進(jìn)行說明，重點(diǎn)對原料藥中肽相關(guān)雜質(zhì)的來源和鑒定進(jìn)行分析，為合成肽原料藥的質(zhì)量控制研究提供了參考，該通則也包含多肽原料合成所需起始原料的相關(guān)內(nèi)容，但并未詳細(xì)展開，主要涉及的是合成肽原料藥的雜質(zhì)分析與控制。2022年1月，美國藥典會(huì)的生物制品各論1-多肽和寡核苷酸專家委員會(huì)在美國藥典論壇對新的1504通則（合成肽起始原料的質(zhì)量屬性）征求意見[16]。該通則概述了合成肽生產(chǎn)中的起始原料所需的最低質(zhì)量屬性，旨在為合成肽類藥物生產(chǎn)中使用的起始原料的質(zhì)量控制提供指導(dǎo)。通則集中討論了9-芴甲氧羰基保護(hù)基（Fmoc）保護(hù)的氨基酸衍生物的質(zhì)量要求，適用于所有的多肽起始原料，并特別說明通則1504應(yīng)與通則1503結(jié)合使用，多肽生產(chǎn)企業(yè)不能因?yàn)槿狈ο嚓P(guān)指南而疏于建立原料供應(yīng)商的質(zhì)量體系，應(yīng)建立與生產(chǎn)工藝和風(fēng)險(xiǎn)管控相關(guān)的質(zhì)量體系。對原料供應(yīng)商合成路徑的評估應(yīng)著重關(guān)注：（1）建議原料供應(yīng)商的生產(chǎn)質(zhì)量體系的運(yùn)行應(yīng)能保證批次穩(wěn)定和生產(chǎn)可追溯；（2）建議與供應(yīng)商建立技術(shù)協(xié)議或質(zhì)量協(xié)議，供應(yīng)商在改變合成路線或工藝的時(shí)候應(yīng)通知客戶；（3）生產(chǎn)企業(yè)必須評估更換供應(yīng)商或起始原料生產(chǎn)工藝的重大變化對藥物質(zhì)量屬性的影響；（4）在接收合成肽起始原料時(shí)，應(yīng)確認(rèn)供應(yīng)商是否具有足夠的認(rèn)證計(jì)劃和控制策略，供應(yīng)商對合成肽起始原料的質(zhì)量要求應(yīng)與合成肽原料藥質(zhì)量影響的評估一致。目前該通則尚在修訂階段，還未正式收載入美國藥典。我國的多肽類藥物開發(fā)起步較晚，專門針對合成肽類藥物質(zhì)量研究和開發(fā)的技術(shù)文件還比較少，目前尚處于研究探索階段。
2007年，原國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，該指導(dǎo)原則對國內(nèi)合成肽藥物的生產(chǎn)制備、結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定以及穩(wěn)定性研究的開展提出了一般要求。在具體內(nèi)容上，重點(diǎn)闡明了合成肽藥學(xué)研究的特點(diǎn)，提出研究需關(guān)注的問題，分析總結(jié)了該類藥物藥學(xué)研究所涉及的特殊問題，對多肽藥物的研究和開發(fā)提供了針對性的指導(dǎo)。但該指導(dǎo)原則在內(nèi)容上過于偏重于原則性的要求，對其中的一些更加深入的技術(shù)問題，如有關(guān)物質(zhì)研究方法、起始原料的要求、非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的控制和研究等并未進(jìn)行更深入的探討。藥品審評中心的王鵬、康建磊等[17-19]結(jié)合該指導(dǎo)原則起草的背景和合成肽類藥物注冊技術(shù)審評工作的具體實(shí)踐，對以上一系列關(guān)鍵問題進(jìn)行了解讀，對已頒布的指導(dǎo)原則的順利實(shí)施是有益的補(bǔ)充。《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》對合成肽藥物的藥學(xué)研究提出了一般性技術(shù)要求。該指導(dǎo)原則主要包括前言、原料藥制備工藝、結(jié)構(gòu)確證、制劑處方工藝、質(zhì)量研究與控制和穩(wěn)定性研究六部分。2023版指導(dǎo)原則是在2007版指導(dǎo)原則的基礎(chǔ)上，充分借鑒了FDA、EMA等相關(guān)指導(dǎo)原則，結(jié)合了國內(nèi)外最新的技術(shù)要求和國內(nèi)研發(fā)實(shí)際情況，對生產(chǎn)制備工藝、結(jié)構(gòu)確證和質(zhì)量研究等內(nèi)容制定了相對統(tǒng)一的技術(shù)要求。現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱中國藥典）二部目前收載了胸腺五肽、胸腺法新和生長抑素等多個(gè)合成肽品種各論，收載的唯一專門針對合成多肽的通用技術(shù)要求是合成多肽中的醋酸測定法。該通則自2010年版始增加于二部附錄，并在2010年版增補(bǔ)本中對部分內(nèi)容進(jìn)行了修訂。中國藥典2015年版首次將上版藥典附錄整合為通則，并與藥用輔料單獨(dú)成卷作為中國藥典四部，該項(xiàng)通用技術(shù)要求在該版藥典被列入四部通則限量檢查法[20]。雖然篇幅簡短，但在藥典通用技術(shù)中對合成肽的質(zhì)量控制要求終于有了零的突破，對于企業(yè)進(jìn)行方法開發(fā)和質(zhì)量控制具有積極的指導(dǎo)作用。本課題組在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，該方法存在著以下不足：（1）采用通則中0.42%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH需要大約80～90 mL堿液，有待完善；（2）洗脫程序梯度變化對色譜柱損害較大，建議應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化；（3）方法中對于系統(tǒng)適用性要求還比較簡單，建議增加主峰面積的RSD等量化要求。國外藥典對于該通用技術(shù)方法的更新較快，美國藥典自39版起增訂了多肽中的醋酸測定法2，增加了可以采用醋酸鈉作為對照品的內(nèi)容，克服了冰醋酸對照品由于易揮發(fā)不能準(zhǔn)確稱量的缺點(diǎn)，并補(bǔ)充了采用磷酸鹽緩沖液體系進(jìn)行洗脫的方法，給予方法開發(fā)者更多的選擇和參考[21]。此外，國家藥典委員會(huì)理化分析專業(yè)委員會(huì)委托本課題組牽頭承擔(dān)完成了“藥品中氨基酸分析法的建立”課題，擬定了中國藥典氨基酸分析指導(dǎo)原則。該指導(dǎo)原則在國家藥典委員會(huì)官網(wǎng)經(jīng)過兩輪公示征求意見[22]，預(yù)計(jì)將會(huì)增訂于中國藥典2020年版增補(bǔ)本，這將有助于合成肽生產(chǎn)企業(yè)在質(zhì)量研究時(shí)選擇適宜的氨基酸分析方法。綜上所述，我國專門針對合成肽類藥物的相關(guān)技術(shù)要求文件頒布的進(jìn)程較緩慢。目前國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心的胡玉璽等結(jié)合國內(nèi)藥品審評的新形勢和新要求，在相關(guān)文獻(xiàn)[23-25]中對我國合成多肽藥物的制備工藝和過程控制、合成多肽藥物的質(zhì)控及雜質(zhì)譜研究以及仿制藥研發(fā)和一致性評價(jià)等進(jìn)行了梳理與探討。相信隨著國內(nèi)合成肽類藥物產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展和藥品研發(fā)理念的更新，針對該類藥物的開發(fā)指導(dǎo)性的文件將會(huì)不斷趨于完善。歐洲藥典除收載合成肽品種各論和相關(guān)通用技術(shù)要求外，在藥用物質(zhì)通則（通則2034，Substances for Pharmaceutical Use）[26]中專門對合成肽類藥物有關(guān)物質(zhì)的控制限度進(jìn)行了明確的規(guī)定：應(yīng)分別將0.1%、0.5%和1.0%作為化學(xué)合成肽類藥物有關(guān)物質(zhì)的報(bào)告限、鑒定限和界定限。2 0 1 8 年， 歐洲藥品質(zhì)量和健康保障局（EDQM）發(fā)布更新了“合成肽和重組D N A蛋白質(zhì)藥物各論標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)指南（第二版）”（Technical Guide for the Elaboration of Monographs onSynthetic Peptides and Recombinant DNA Proteins）[27]。該技術(shù)指南的目的是向標(biāo)準(zhǔn)起草者、審核者和使用者提供合成肽和重組DNA蛋白原料各論標(biāo)準(zhǔn)的制定規(guī)范，制劑品種并不在本指南的討論范圍。該指南針對合成肽類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的品種名稱、定義、性狀、鑒別、檢查（包括相關(guān)肽、旋光度、吸光度、反離子、干燥失重或水分、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查等）、含量測定、貯藏條件及標(biāo)簽等進(jìn)行了一般概括性的說明，對我國合成肽類藥物研發(fā)人員具有一定的參考意義。3 合成肽類藥物質(zhì)量控制要點(diǎn)與傳統(tǒng)的化學(xué)小分子藥物相比，合成肽類藥物具有特殊的結(jié)構(gòu)和質(zhì)量屬性。特定的質(zhì)量屬性對分析方法的開發(fā)提出了更高的要求與挑戰(zhàn)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)根據(jù)相關(guān)技術(shù)指南和通用技術(shù)要求制定藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)的研究與提高應(yīng)持續(xù)貫穿于合成肽類藥物研發(fā)、生產(chǎn)和上市后的所有過程。下面將從合成肽類藥物的結(jié)構(gòu)表征、肽相關(guān)雜質(zhì)的控制與分析以及合成肽質(zhì)量控制用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制三個(gè)方面對該類藥物的質(zhì)量控制研究作簡要的探討。3.1 合成肽類藥物的結(jié)構(gòu)表征合成肽類藥物的結(jié)構(gòu)表征應(yīng)覆蓋藥物研究的整個(gè)生命周期，是藥物質(zhì)量研究的重要組成部分。結(jié)構(gòu)決定功能，正確的結(jié)構(gòu)對于藥物的藥效甚至生物活性的發(fā)揮起到?jīng)Q定作用。結(jié)構(gòu)研究一般包括HPLC鑒別、紅外光譜鑒別、質(zhì)譜法測定單同位素分子量、核磁共振法測定結(jié)構(gòu)、氨基酸組成分析、串聯(lián)質(zhì)譜法測定氨基酸序列、化學(xué)或酶法進(jìn)行肽圖分析、光學(xué)純度分析、末端序列分析和圓二色譜，以及核磁共振光譜法等進(jìn)行高級結(jié)構(gòu)分析等。國外藥典部分合成肽品種使用核磁共振法對藥物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，如歐洲藥典項(xiàng)下有布舍瑞林、戈舍瑞林和戈那瑞林等合成肽在鑒別項(xiàng)采用核磁共振法對結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征[28-30]，而美國藥典的血管緊張素、去氨加壓素和戈那瑞林[31-33]在鑒別時(shí)更傾向于采用質(zhì)譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。合成肽類藥物的常規(guī)質(zhì)控中，一般推薦選擇兩種不同原理的方法進(jìn)行鑒別，最常用的方法有化學(xué)鑒別（雙縮脲反應(yīng)）、肽圖鑒別、HPLC鑒別、質(zhì)譜法鑒定分子量等。肽圖鑒別適用于由20個(gè)以上氨基酸組成的多肽藥物，根據(jù)多肽分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用肽鏈內(nèi)切酶將多肽序列水解成多個(gè)小肽結(jié)構(gòu)，進(jìn)而定性分析供試品與對照品結(jié)構(gòu)的一致性，專屬性較好?；陔p縮脲反應(yīng)的化學(xué)鑒別方法由于專屬性較差，因此建立鑒別方法時(shí)主要從后三種方法中選擇。多肽藥物的一級結(jié)構(gòu)的表征主要包括氨基酸組成分析和氨基酸序列分析。二者側(cè)重點(diǎn)不同，前者主要說明多肽結(jié)構(gòu)中氨基酸組成的正確性，后者主要側(cè)重氨基酸連接順序的正確性，在多肽藥物的申報(bào)資料中不能互相取代。氨基酸組成分析（氨基酸比值）在很多合成肽類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中較常見，但序列分析一般不包括在常規(guī)檢驗(yàn)中。中國藥典和歐洲藥典收載的多肽藥物品種各論中，氨基酸比值主要是作為檢查項(xiàng)，在美國藥典一般列入鑒別項(xiàng)。是否一定將氨基酸組成分析訂入多肽藥物質(zhì)量標(biāo)也不是一概而論，需要針對每個(gè)品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目整體的設(shè)置情況來具體分析。如中國藥典收載的胸腺法新、鮭降鈣素等品種各論[34-35]，鑒別項(xiàng)目為色譜鑒別或肽鍵的化學(xué)鑒別，所表征的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)信息較少，因此將氨基酸比值作為檢查項(xiàng)來進(jìn)一步地表征產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特征。而美國藥典收載的特立帕肽，采用HPLC法和肽圖進(jìn)行鑒別，兩種方法原理不同且專屬性均較強(qiáng)，未再設(shè)置氨基酸比值來表征產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特征。多肽藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的組成單元為氨基酸，除甘氨酸外，其他的蛋白質(zhì)氨基酸均具有光學(xué)活性，氨基酸光學(xué)活性的疊加構(gòu)成了多肽藥物的旋光特性，旋光度在一定程度可以表征多肽藥物的結(jié)構(gòu)特征、化學(xué)純度或含量，但隨著肽鏈長度增加，多肽化學(xué)結(jié)構(gòu)趨于復(fù)雜。除一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列會(huì)產(chǎn)生光學(xué)活性的疊加外，高級結(jié)構(gòu)（如α螺旋）也會(huì)對比旋度產(chǎn)生重要影響。如果多肽藥物有比較穩(wěn)定的立體結(jié)構(gòu)，比旋度可以一定程度地表征產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特征，若不具有非常穩(wěn)定的高級結(jié)構(gòu)，比旋度會(huì)隨著松散的立體結(jié)構(gòu)而發(fā)生不可控的波動(dòng)變化，此時(shí)比旋度不具有產(chǎn)品結(jié)構(gòu)表征意義。3.2 肽相關(guān)雜質(zhì)控制與分析在藥物雜質(zhì)譜分析中，藥品中的雜質(zhì)按照其屬性常被分為無機(jī)雜質(zhì)、揮發(fā)性雜質(zhì)（通常指殘留溶劑）和有機(jī)雜質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)）三類。應(yīng)采用不同的分析技術(shù)對不同類型的雜質(zhì)進(jìn)行分析控制。藥品中有機(jī)雜質(zhì)需要按照QbD（Quality by Design）的理念進(jìn)行研究。肽相關(guān)雜質(zhì)（有關(guān)物質(zhì)）是指與合成肽目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)有關(guān)的雜質(zhì)，屬于有機(jī)雜質(zhì)的范疇，主要分為工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)。工藝雜質(zhì)主要的引入途徑有起始原料中的雜質(zhì)、肽鏈合成過程中的副反應(yīng)等，通過對起始物料、合成和裂解工藝參數(shù)的控制來減少或避免工藝雜質(zhì)的產(chǎn)生，并在后續(xù)純化步驟實(shí)現(xiàn)大部分雜質(zhì)的有效清除。降解雜質(zhì)主要是指在穩(wěn)定性儲(chǔ)存期間受pH、水分、溫度、光照、氧氣等因素的影響發(fā)生降解作用而產(chǎn)生的雜質(zhì)，部分降解雜質(zhì)也可能來自工藝過程。降解雜質(zhì)控制主要是通過降低工藝過程的降解、優(yōu)化產(chǎn)品儲(chǔ)存條件（如包材密封性、避光性以及水分、pH、充氮、存儲(chǔ)溫度）等因素來降低雜質(zhì)的增加速度，確保產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存以及運(yùn)輸期間安全。美國藥典1503通則歸納總結(jié)了所有肽相關(guān)雜質(zhì)的類別、來源、相關(guān)性以及為了鑒定以上雜質(zhì)所推薦采用的分析技術(shù)。一般來講，肽相關(guān)雜質(zhì)的類型主要包括缺失肽、插入肽、替換肽、斷裂肽、立體異構(gòu)體、Asp/Asn有關(guān)的雜質(zhì)、β-丙氨酸插入、焦谷氨酸、聚合物、二硫鍵還原雜質(zhì)以及氨基官能團(tuán)乙?；s質(zhì)、含芳香族或含硫側(cè)鏈氧化雜質(zhì)、一級氨基酸的烷基化和?；氲碾s質(zhì)等。肽關(guān)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)表征和定量分析的主要技術(shù)是串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）和與液相色譜高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用（LC/hrMS）技術(shù)。本課題組在對鮭降鈣素注射液降解雜質(zhì)進(jìn)行分析時(shí)，結(jié)合多肽裂解規(guī)律，通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，推斷出3個(gè)主要降解雜質(zhì)降鈣素C、三硫鮭降鈣素和脫氫丙氨酸鮭降鈣素二聚體的化學(xué)結(jié)構(gòu)[36]。液相色譜高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有更高的選擇性、靈敏度，在肽類藥物及肽相關(guān)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征和定量分析中被廣泛應(yīng)用。Kui Zeng等[37]以3種肽類藥物為模型系統(tǒng)，建立了液相色譜-高分辨率質(zhì)譜方法，以評估該方法在肽類藥物質(zhì)控方面的適用性。對于肽相關(guān)雜質(zhì)，在分析方法開發(fā)階段，應(yīng)盡可能選擇不同原理的分析方法進(jìn)行全面的研究。常規(guī)檢驗(yàn)多采用高效液相色譜法，推薦采用正交色譜分離技術(shù)對合成肽中的不同類型的肽相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行分析：含有疏水殘基的多肽主要是通過反相色譜梯度洗脫模式；對于親水性的肽則傾向于采用親水作用的色譜分離模式；合成肽的聚合物雜質(zhì)，一般采用SEC（尺寸排阻色譜法）對多聚體進(jìn)行分析和定量。反相色譜洗脫時(shí)，一般多從三氟醋酸乙腈-水、硫酸鹽溶液-乙腈和磷酸緩沖鹽溶液-乙腈等不同的系統(tǒng)進(jìn)行篩選，由于離子對試劑三氟醋酸和非揮發(fā)性緩沖鹽的使用，多數(shù)肽相關(guān)雜質(zhì)的分析方法無法和質(zhì)譜兼容。預(yù)計(jì)未來合成肽類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)將會(huì)有更方便的流動(dòng)相添加劑，便于LC-MS對雜質(zhì)的直接識別。3.3 合成肽質(zhì)量控制用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和檢測方法是藥物質(zhì)量控制的兩個(gè)重要技術(shù)支撐點(diǎn)，性質(zhì)穩(wěn)定均一的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是方法建立過程中必不可少的重要因素。合成肽質(zhì)量控制用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以理化測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為主，而含量測定用化學(xué)對照品在合成肽質(zhì)量控制體系中具有舉足輕重的作用。這是因?yàn)楹铣呻念愃幬锏暮恳话闶且詿o水、無反離子（如醋酸或其他酸）計(jì)，以含量測定用對照品為外標(biāo)來表示肽的含量，對照品的準(zhǔn)確賦值直接關(guān)系到藥品的有效性。目前主要采取以下四種方法對肽的含量測定用對照品進(jìn)行賦值[38-40]：質(zhì)量平衡法、核磁共振定量法、肽雜質(zhì)校正定量氨基酸法、肽雜質(zhì)校正氮含量法測定肽含量。其中，質(zhì)量平衡法是對照品賦值采用的最主要方法，該方法從100%中扣除水、反離子、其他非肽雜質(zhì)（如無機(jī)雜質(zhì)、殘留溶劑）的含量，再乘以主成分的純度。定量核磁共振光譜法需要選擇合適的內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)的信號需要與肽的信號完全分離。一般來講，進(jìn)行對照品的首批研制標(biāo)定時(shí)，除采用第一種方法外，通常還會(huì)在后三種方法中再選取一種對質(zhì)量平衡法的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)。我院在對首批甘氨酰-L-酪氨酸國家對照品的標(biāo)定研究[41]中，分別采用核磁共振定量法和質(zhì)量平衡法兩種不同原理方法進(jìn)行賦值，結(jié)果基本一致，最終選擇質(zhì)量平衡法的結(jié)果進(jìn)行賦值。在選擇后兩種賦值方法時(shí)需要特別注意的是，因?yàn)槎堪被岱治龇ê偷繙y定法都是通過絕對法來測定肽的含量，最終賦值時(shí)一定要用肽相關(guān)雜質(zhì)分析來進(jìn)行校正，即肽含量乘以主成分的純度進(jìn)行校正。本課題組在合成肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核工作中發(fā)現(xiàn)，有企業(yè)提供的原料藥和雜質(zhì)對照品的研究報(bào)告未經(jīng)校正將絕對法測定的肽含量作為最終含量，直接影響到含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。在研制過程中本課題組還發(fā)現(xiàn)，除賦值方法外，對照品的制備方式是影響合成肽含量測定對照品結(jié)果準(zhǔn)確性的另一個(gè)主要原因，這主要?dú)w因于肽的高引濕性。制備時(shí)如果采用粉末直接稱量分裝的方式，應(yīng)充分驗(yàn)證分裝環(huán)境濕度是否會(huì)導(dǎo)致對照品瓶間水分的不均一。一般建議采用溶液灌裝分裝后再凍干的方式來制備合成肽對照品，但需要對灌裝前和整個(gè)灌裝過程中溶液的均一性進(jìn)行驗(yàn)證。合成肽對照品一般進(jìn)行冷藏或冷凍保存，需要定期進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測。
近年來，隨著醫(yī)藥工業(yè)對于合成肽類藥物質(zhì)量控制實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的不斷積累、分析手段的持續(xù)進(jìn)步，以及質(zhì)量源于設(shè)計(jì)、風(fēng)險(xiǎn)評估等國際先進(jìn)藥品質(zhì)量控制理念的逐步推廣，進(jìn)一步推動(dòng)了相關(guān)指南和通用技術(shù)要求的頒布與修訂，使合成肽類藥物的質(zhì)量有了進(jìn)一步提升的空間。但實(shí)際工作中難點(diǎn)尚存，如隨著聚乙二醇化（PEG化）等長效化技術(shù)手段在合成肽類藥物的應(yīng)用，以及植入劑、微球注射劑、脂質(zhì)體注射劑、納米粒注射劑等合成肽新劑型的開發(fā)，合成肽類藥物的質(zhì)量控制研究還存在諸多挑戰(zhàn)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)結(jié)合藥物本身的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，確定質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn)，研究建立適合的分析方法、質(zhì)控方案與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保證產(chǎn)品安全有效、質(zhì)量可控。
作者丨任麗萍 范慧紅（中檢院）
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